稻米品质突变体库的构建及粉质胚乳垩白突变体(flo6)的基因定位

摘要

水稻是主要粮食作物之一，其基因组的全序列测定已经完成，但基因组中多数基因的功能仍是未知。所以，对基因功能的注释与研究已成为单子叶模式植物水稻遗传学与分子生物学研究的重点。本研究利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理已完成测序的粳稻品种日本晴构建包括垩白、蒸煮品质、营养品质性状在内的水稻品质性状突变体库。利用近红外光谱分析对一个包含2210份诱变处理材料的群体进行2次筛选，对获得的品质突变体进行化学分析验证，确定了该突变体的突变性状。同时对其中一份垩白突变体进行了基因定位。得到结果如下:
　　 1.在外观品质和蒸煮品质方面获得27份突变体。其中垩白突变体5份(突变频率为2.26‰)、直链淀粉含量突变体5份(2.26‰)、胶稠度突变体4份(1.81‰)、碱消值突变体2份(0.90‰)、糊化温度突变体4份(1.81‰)、稻米米粉黏滞性突变体7份(3.17‰)。
　　 2.在营养品质方面获得61份突变体。以相对含量低于或高于野生型10％作为筛选标准，对诱变群体的不同氨基酸含量和蛋白质含量进行了突变体筛选。结果共获得赖氨酸突变体1份(0.45‰)、亮氨酸突变体1份(0.45‰)、缬氨酸突变体11份(4.98‰)、谷氨酸突变体1份(0.45‰)、精氨酸突变体7份(3.17‰)、丙氨酸突变体6份(2.71‰)、丝氨酸突变体、甘氨酸突变体各1份(各0.45‰)、酪氨酸突变体3份(1.36‰)、脯氨酸突变体5份(2.26‰)、组氨酸突变体1份(0.45‰)、蛋氨酸突变体5份(2.26‰)，半胱氨酸突变体7份(3.17‰)、蛋白质含量突变体11份(4.98‰)。异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸，天冬氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸未筛选到相应的突变体。
　　 3.利用一个粉质胚乳垩白突变体(flo6）构建了定位群体，flo6垩白突变体具有大垩白、胚乳中心部位淀粉粒结合松散等突变性状。同时还具有千粒重下降、籽粒变小、胶稠度变软、糊化温度降低和稻米粉的黏滞性系数降低等特性;但蛋白质含量有所提高，其中多种氨基酸含量也发生了明显变化。遗传分析表明此垩白突变为隐性单基因突变。
　　 4.通过图位克隆策略将垩白突变基因定位在1号染色体长臂中段区域约500kb范围内。根据水稻基因组注释计划(RAP)数据库的相关注释信息，对候选区段内的推定基因进行分析，其中编号为LOC_Os01g44220的基因被初步确定为突变基因。该基因编码水稻AGPase的一个大亚基OsAGPL2，催化着AGPase淀粉合成途径中第一步反应的合成，是水稻淀粉合成的主要限制因素。测序结果表明该基因的第4个转录本LOC_Os01g44220.4的第10号外显子发生了一个碱基的突变(G→A)，导致其转录蛋白序列也产生变异(E→K)。
　　 5.由于DNA序列单碱基替换引起的蛋白质序列氨基酸替换没有导致AGPase大亚基OsAPL2功能的完全丧失，蛋白质三级结构的预测结果表明突变位点只引起了二级结构的微小改变，但突变位点紧邻AGPase与ADP-Glu互作区域，且由带负电荷的谷氨酸突变为带有正电荷的赖氨酸，影响了互作区域的电荷环境，进而影响了AGPase的催化能力。所以，基于以上关于突变位点对蛋白质序列的影响及AGPase作用模型分析，推测在胚乳发育早期大亚基OsAPL2参与构成的AGPase复合物在细胞质内含量较低，且由于突变造成的催化功能降低，质体内由OsAPS1和OsAPL1形成的AGPase复合物的酶活性较低（约为5％），大部分是由细胞质型AGPase提供催化活性，造成胚乳淀粉合成底物ADP-G的量不足，减少了淀粉的合成，形成早期发育部位淀粉粒结合松散的性状。后期大亚基OsAPL2含量迅速增加，弥补了由于突变而造成的AGPase催化能力的下降，使得ADP-G合成趋于正常，以至胚乳淀粉积累也恢复正常，最终形成了胚乳内部呈粉质而外部边缘正常的flo6垩白突变体的突变表型。

目录

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致谢

论文说明

摘要

缩写、符号清单、术语表

1 引言

2 文献综述

2．1 水稻基因组测序研究

2．2 水稻基因组注释计划

2．3 水稻突变体的创建

2．3．1 功能基因组的研究

2．3．2 水稻突变体库的创建方法

2．4 水稻突变体的分类

2．5 近红外光谱分析技术在稻米品质测定中的应用

2．6 水稻淀粉生物合成

2．7 水稻垩白的相关研究

2．7．1 垩白研究的重要性

2．7．2 垩白的形成因素研究

2．7．3 垩白突变体的研究

3 材料与方法

3．1 水稻材料

3．2 稻米品质近红外分析方法

3．3 稻米品质化学分析方法

3．4 水稻籽粒体视镜扫描电镜及观测

3．5 基因定位

3．5．1 DNA提取

3．5．2 SSR及In／Del标记筛选

3．5．3 连锁分析

3．5．4 基因定位的数据分析

3．5．5 In／Del标记开发

3．5．6 侯选基因预测及测序

3．5．7 候选基因蛋白质序列及其突变序列的生物信息学分析

4 结果与分析

4．1 垩白突变体筛选

4．1．1 垩白突变体的初步检测

4．1．2 垩白突变体的垩白观察和分析

4．1．3 垩白突变体的扫描电子显微镜分析

4．2 蒸煮品质突变体筛选

4．2．1 直链淀粉含量突变体筛选

4．2．2 胶稠度突变体筛选

4．2．3 碱消值突变体筛选

4．2．4 糊化温度突变体筛选

4．2．5 淀粉黏滞性突变体筛选

4．3 营养品质突变体筛选

4．4 垩白突变体的基因定位

4．4．1 垩白突变体的形态描述

4．4．2 垩白突变体的品质分析

4．4．2 垩白突变体的基因定位

5 讨论

5．1 日本晴品质突变体库的创建

5．2 粉质胚乳垩白突变体(flo6)的基因定位

6 研究展望

6．1 关于品质突变体库的研究展望

6．2 关于flo6突变体的研究展望

参考文献

8 附录

附录1：垩白基因定位候选区段内86个ORFs的名称、位置和注释信息

附录2：flo6突变体基因定位所设计InDel引物

附录3：LOC_Os01g44220的7个转录产物及flo6突变体的蛋白序列比对结果

附录4：籼稻R9703与粳稻nipponbare的多态性分子标记

附录5：本研究发表相关论文

9 作者简历