维甲酸对鸡胚生殖细胞和减数分裂调控的研究

摘要

家禽的胚胎发育有独特的规律，通过对家禽原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)的体外研究，可以更深入地了解其胚胎发育过程及影响因素，并可对其基因进行遗传操作，制作各种研究模型，从而为生殖生物学和发育生物学等研究提供了一个优良的动物模型。为了更深层次揭示禽类生殖细胞增殖和分化的细胞内部和外源性调控机理、性腺发育和配子形成的分子机理，本实验以海兰鸡鸡胚为材料，分离了不同时期的PGC，进行体外培养并优化培养模型，研究了维甲酸(RA)对PGC粘附和增殖的作用及其胞内信号传导机制，同时还研究了RA对胚胎期卵巢生殖细胞减数分裂启动过程中的调控作用，探索基于LV-siRNA的慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性，建立Raldh2基因敲除的转基因鸡模型，为进一步研究胚胎早期发育的机理、转基因家禽的制备奠定了基础。
　　 1.鸡胚PGC的分离、培养及鉴定
　　 在体视显微镜下用玻璃针分离19期3.5d鸡胚生殖嵴部位或28期5.5d鸡胚性腺，胰蛋白酶+EDTA消化分散组织，用KO-DMEM添加7.5％胎牛血清和10 ng/ml白血病抑制因子(LIF)、10 ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)、10 ng/ml干细胞生长因子(SCF)、0.1mMMEM非必需氨基酸、0.1 mMβ-巯基乙醇、2mML-谷氨酰胺(Glu)、100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养液，通过PGC和体细胞体外共培养的方式建立原代培养模型。然后传代于鸡胚成纤维细胞饲养层上进行继代培养。同时我们从13-15期鸡胚血液中分离提取PGC，在饲养层上进行原代和传代培养。传至3-5代后，用碱性磷酸酶（AKP）、过碘酸雪夫氏(PAS)化学反应及c-kit、SSEA-1，3，4、EMA-1等免疫细胞化学鉴定PGC，用PCNA和BrdU掺入法检测细胞的增殖活性。并收集PGC集落，采用RT-PCR方法检测干细胞多能性相关基因(Pou5f1，Sox2和Nanog)的表达。上述结果表明我们建立的PGC-体细胞共培养模型较好的维持了PGC的生物特性及未分化状态，且具有较强的增殖活性。因此，该模型是可用于PGC体外增殖和分化调控的研究。
　　 2.RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其机理的研究
　　 本实验研究了RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其相关的信号传导途径。结果表明:经过RA（0.1-10μM）处理后，PGC的集落数目和面积呈时间和剂量依赖性增加。同时RA能够促进细胞间的粘附，提高粘附蛋白E-钙粘蛋白、α-连锁蛋白和β-连锁蛋白的mRNA水平，增强PGC的粘附性，并存在一定的剂量效应关系。流式分析结果显示，PGC经过RA处理4天后，S/G2期(4N)的PGC数量显著增加，说明此部分细胞已经进入有丝分裂期。此外，RA能激活PGC中PKC和Akt活性，促进NF-κB的核转移，提高钙粘蛋白和β-catenin的磷酸化水平，然而这些刺激作用分别被LY294002（PI3K抑制剂），KP372-1（Akt抑制剂），SN50(NF-κB抑制剂)和H7（PKC抑制剂）所阻断。RA显著上调PGC中细胞周期蛋白cyclin D1/E, CDK2/6和原癌基因c-fos，c-myc的表达，但是这种上调作用被H7、LY294002、KP372-1和SN50所抑制。综上所述，在体外培养条件下，RA通过PI3K/Akt/NF-κB信号级联反应及与PKC/β-catenin之间的交联反应促进鸡胚PGC的增殖，揭示RA在调控鸡胚胎生殖细胞发育中起着重要的作用。
　　 3.RA对鸡胚生殖细胞减数分裂的调控机理的研究
　　 在本实验中，我们结合胚胎期卵巢的体外培养和RNA干扰等手段，探索RA对鸡胚胎期生殖细胞减数分裂的调控及作用机制。SCP3和γH2AX免疫荧光染色结果表明，鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂，比例逐渐增加，到18.5天，进入减数分裂的细胞几乎遍布整个卵巢。减数分裂早期标志基因Strs8 mRNA的表达在12.5天开始显著上调，早于减数分裂启动的时间;而减数分裂标志基因Scp和Dmcl mRNA的表达则在15.5天显著上调，再次验证鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂;RA合成酶基因Raldh2在15.5天显著上调而降解酶Cyp26b1却逐渐下降，表明Raldh2在RA聚集并维持减数分裂中的重要作用;RA受体RARβ则略微升高，表明其在RA启动减数分裂中的介导作用。而在雄性睾丸中，这些基因的表达变化很小，一直保持较低水平。10.5天和12.5天鸡胚卵巢在无血清的体外培养体系中分别培养5天和3天，生殖细胞能自发启动减数分裂;在培养体系中添加RA能明显增加进入减数分裂的细胞比例，显著上调了减数分裂相关基因Stra8，Scp3和Dmc1的mRNA表达水平。Raldh2 shRNA干扰后显著抑制了RA诱导减数分裂启动的作用。综上所述，我们的研究表明，RA及其信号通路对减数分裂启动中的重要调控作用，并首次报道了Raldh2基因敲减能够显著抑制生殖细胞进入减数分裂。
　　 4.利用shRNA慢病毒载体制备转基因鸡模型研究生殖细胞的发育
　　 本实验采用RNA干涉（RN Ai）的方法，成功设计了三对针对Raldh2基因序列的保守区域的shRNA（short hairpin）分子，并构建质粒干涉载体。转染鸡胚15.5天卵巢生殖细胞后，转染效率达到80％-90％。通过qRT-PCR及SCP3免疫荧光染色检测，结果表明Raldh2-gallus-1224很好的抑制了Raldh2的表达，成功筛选出能高效抑制Raldh2复制的靶位点。针对有效位点构建了携带有能高效抑制Raldh2的shRNA慢病毒载体，将包装后的病毒注射到X期鸡胚胚盘内进行转基因操作，建立Raldh2基因敲减的转基因鸡模型。结果发现Raldh2基因敲减的转基因鸡胚外观与对照组的鸡胚相比无明显差异，卵巢形态大致正常，应用PCR检测GFP在胚体内的表达，进一步证实我们成功制备了转基因鸡模型，且qRT-PCR检测到Raldh2的表达显著下降。本实验为探索基于LV-siRNA慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性，建立基因敲减的转基因鸡模型，为研究卵泡发育的分子机制奠定基础。
　　 以上实验结果表明:鸡胚PGC的体外共培养模型可用于PGC增殖和分化调控的研究，经AKP、PAS及c-kit、SSEA-1、3、4和EMA-1免疫细胞化学染色和干细胞多能性相关基因(Pou5f1，Sox2和Nanog)表达的RT-PCR检测等多种方法证实了PGC的原始性。利用此模型我们研究了维甲酸在PGC体外培养中的促增殖和粘附作用及其分子机理;我们还描述了鸡胚卵巢生殖细胞体内减数分裂启动中的形态学和分子变化，通过组织培养和RNA干扰等手段研究了RA对减数分裂启动的调控作用。这些发现将为禽类干细胞系的建立和转基因模型的制备奠定基础，同时也为进一步研究生殖细胞的发育提供理论指导和实验平台。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

第一节 禽类原始生殖细胞的研究进展

1．1 干细胞的起源

1．2 干细胞的生物学特性

1．3 禽类PGC的特性

1．4 PGC的起源

1．5 禽类PGC的迁移

1．6 原始生殖细胞的应用

1．7 小结

第二节 细胞外基质对PGC迁移的影响及调控

2．1 粘附蛋白的结构和影响因素

2．2 E-钙粘蛋白的结构和功能调节

2．3 粘附分子在细胞信号传导中的作用

2．4 粘附分子在生殖细胞发育中的作用

2．5 ECM在PGC迁移中的作用

第三节 禽类原始生殖细胞增殖的调控

3．1 PGC的增殖

3．2 生长因子对PGC增殖的调控

3．3 细胞信号通路对PGC增殖的调控

3．4 细胞周期相关基因控制PGC的增殖

第四节 禽类原始生殖细胞分化的调控

4．1 禽类性腺发育

4．2 禽类性腺发育的调控及其机理

4．3 卵母细胞发生的分子调控

第五节 利用转基因技术研究生殖细胞发育的调控机理

5．1 转基因鸡的研究现状

5．2 RNA干扰的研究进展

5．3 转基因鸡的制备方法

5．4 RNAi转基因动物的研究

第六节 本研究的目的和内容

6．1 本研究的目的和意义

6．2 研究目标及内容

第二章 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞粘附调控机理的研究

第一节 鸡胚原始生殖细胞体外培养模型的建立及优化

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 小结

第二节 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞粘附的影响及其机理的研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞增殖调控的研究

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．2．1 实验动物

1．2．2 主要器材

1．2．3 主要试剂及配制

1．2．4 PGC培养及药物处理

1．2．5 BrdU掺入鉴定PGC的增殖

1．2．6 细胞周期流式分析

1．2．7 RNA提取和常规RT-PCR

1．2．8 Real-Time RT-PCR

1．2．9 蛋白质的提取和Western Blot分析

1．2．10 数据分析

1．3 结果

1．3．1 RA在体外对PGC增殖的影响

1．3．2 PI3K／Akt在RA对PGC促增殖中的介导作用

1．3．3 NF-κB在RA对PGC促增殖中的介导作用

1．3．4 RA及抑制剂对细胞周期蛋白mRNA表达水平的影响

1．3．5 RA及抑制剂对PGC细胞周期的影响

1．4 讨论

1．5 小结

第四章 维甲酸对鸡胚生殖细胞减数分裂调控机理的研究

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．2．1 实验动物

1．2．2 主要器材

1．2．3 主要试剂及配制

1．2．4 样品采集

1．2．5 鸡胚性腺组织培养和处理

1．2．6 鸡胚卵巢生殖细胞的分离培养和处理

1．2．7 Raldh2 siTNA转染

1．2．8 鸡胚性腺组织的冰冻切片

1．2．9 鸡胚性腺组织石蜡切片制作

1．2．10 胚胎期卵巢形态学观察

1．2．11 性腺冰冻切片免疫荧光染色

1．2．12 RNA提取和Real-Time RT-PCR

1．2．13 数据分析

1．3 结果

1．3．1 胚胎期鸡胚卵巢发育的形态学特征

1．3．2 胚胎期鸡卵巢减数分裂阶段的变化

1．3．3 减数分裂相关基因在不同时期鸡胚性腺中的表达情况

1．3．4 RA合成和降解酶在不同时期鸡胚性腺中的表达情况

1．3．5 AO染色观察体外培养卵巢的内部结构

1．3．6 RA在体外对减数分裂的影响

1．3．7 Raldh2 shRNA干扰

1．3．8 Raldh2基因敲减对减数分裂的影响

1．4 讨论

1．5 小结

第五章 利用shRNA慢病毒载体制备转基因鸡模型

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．2．1 实验动物

1．2．2 主要器材

1．2．3 主要试剂及配制

1．2．4 玻璃针的制备

1．2．5 siRNA的设计

1．2．6 病毒滴度的复核(有限稀释法测定)

1．2．7 靶细胞感染预实验

1．2．8 293FT细胞的培养

1．2．9 病毒的生产

1．2．10 病毒滴度分析

1．2．11 鸡胚病毒注射

1．2．12 PCR检测目的基因的表达

1．2．13 数据分析

1．3 结果

1．3．1 慢病毒滴度测定结果

1．3．2 不同转染时间绿色荧光蛋白的表达分析

1．3．3 shRNA高技抑制Raldh2复制靶位点的筛选

1．3．4 转基因个体的PCR分析

1．3．5 转基因鸡胚15．5天卵巢形态

1．4 讨论

1．5 小结

第六章 结论和创新点

1．1 结论

1．2 创新点

参考文献

致谢

博士期间发表文章