球孢白僵菌氨基糖苷磷酸转移酶(Bbaph)与ABC转运蛋白(BbT1)的功能分析

摘要

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)作为一种经典的昆虫病原真菌，在害虫防治中应用广泛。其抗逆分子机理直接关系到生防制剂的田间防效，科学与实践意义重大。本研究开展了对酰基-辅酶A脱氢酶APH结构域即氨基糖苷磷酸转移酶Bbaph的功能分析，并对两种昆虫病原真菌中结构相似的ABC转运蛋白进行功能分析。主要结果如下:
　　 球孢白僵首Bbaph基因的功能球孢白僵菌氨基糖苷磷酸转移酶Bbaph的全长1226bp，含2个外显子和3个内含子，编码366个氨基酸。由Bb2860野生株构建敲除株ΔBbaph和回补株ΔBbaph/Bbaph，进行表型分析。与野生株和回补株相比，△Bbaph产孢量、耐45℃热胁迫的能力、耐UV-B紫外辐射的能力以及对斜纹夜蛾(Spodopteralitura)二龄幼虫的毒力分别下降92％、37％、27％及21％。敲除株对15～45mM过氧化氢和2～3mM甲萘醌氧化胁迫的抵抗力上升18％～50％，对多菌灵、三环唑、申嗪霉素、嘧菌酯、菌核净等不同类型的化学药物的抗性下降10％～68％。除半乳糖之外，多种碳源和无机氮源都促进敲除株生长，而有机氮源则抑制其生长。野生株与回补株之间无任何表型差异。由此说明，Bbaph基因参与调控球孢白僵菌的产孢、生长及多胁迫抗性。
　　 两种昆虫病原真菌中结构相似ABC转运蛋白的功能比较球孢白僵菌和玫烟色棒束孢(Isariafumosorosea)均存在一种结构相似的ATP结合匣即ABC转运蛋白，分别记为BbT1和IfT1。为了比较这一转运蛋白在两种真菌中的的生物学功能，由Bb2860野生株构建BbT1的敲除株和回补株，并将IfT1在BbT1敲除株中异源重组表达，然后测定各菌株的表型。与野生株、回补株及异源重组株相比，敲除株对20～40mM过氧化氢和2～8mM甲萘醌氧化胁迫的抵抗力下降27％～2.1倍，对多菌灵、伊曲康唑、菌核净、放线菌酮、乙嘧酚和4-硝基喹啉N-氧化物等不同类型化学药物的抗药性下降28％～4.7倍，对斜纹夜蛾二龄幼虫的毒力下降20％左右，而野生株、回补株及异源重组株之间无任何显著的表型差异。结果表明，BbT1和IfT1是结构相似且功能一致的ABC转运蛋白，分别是两种生防真菌多药抗性的重要决定因子之一，因参与抗氧化反应而对毒力有所贡献。
　　 综上所述，球孢白僵菌酰基-辅酶A脱氢酶APH结构域即氨基糖苷磷酸转移酶Bbaph和ABC转运蛋白都是产孢、生长及抗逆性状的重要调节因子，后者还是多药抗性的决定因子之一。这些结果增添了生防真菌抗逆分子机理的认识。

目录

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论文说明

致谢

摘要

1 昆虫病原真菌抗逆生物学研究现状

1．1 影响生防真菌制剂防效的环境因素

1．1．1 温度

1．1．2 湿度

1．1．3 光照

1．1．4 化学农药

1．2 酰基-辅酶A脱氢酶研究现状

1．2．1 酰基-辅酶A脱氢酶的结构和功能

1．2．2 真菌酰基-辅酶A脱氢酶的研究现状

1．2．3 APH基因在原核生物中的作用

1．3 ABC转运蛋白及其在抗药性中的作用

1．4 展望

2 球孢白僵菌氨基糖苷磷酸转移酶Bbaph功能分析

2．1 材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 试剂

2．2 方法

2．2．1 核酸提取

2．2．2 Bbaph的克隆及序列分析

2．2．3 载体构建

2．2．4 载体农杆菌转化及根癌农杆菌介导的真菌转化

2．2．5 转化子的鉴定

2．2．6 敲除株、回补株与野生株的表型分析

2．2．7 敲除株与回补株中相关基因的转录水平分析

2．3 结果

2．3．1 基因的敲除和回补

2．3．2 表型变化

2．3．3 表型相关基因转录水平的变化

2．4 讨论

3 两种昆虫病原真菌中结构相似转运蛋白的功能比较

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株、质粒及试剂

3．1．2 DNA提取

3．1．3 BbT1和IfT1的克隆与表达载体构建

3．1．4 根癌农杆菌介导的真菌转化

3．1．5 转化子鉴定

3．1．6 表型分析

3．2 结果和分析

3．2．1 目的基因在转化子中的表达

3．2．2 表型变化

3．3 讨论

4 结语

参考文献