基于EST模型的全氟烷基化合物致心肌发育毒性作用及其定量蛋白质组学研究

摘要

胚胎干细胞测试(embryonic stem cell test，EST)体系以胚胎干细胞(embryonicstem cell，ES cell)分化为心肌细胞模型为基础，是欧洲代替方法验证中心(theEuropean Center for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)提出的作为体外筛选和评价受试物(包括药物或环境中化合物等)可能具有的发育毒性手段。该体系能基本模拟乃至重现体内心肌分化和发育复杂全程，富含大量心肌发育依赖性生物信息，与体内毒性实验相比，具有对药物作用反应迅速、干扰因素少、敏感性高等优点。
　　 全氟烷基化合物(Polyfluorinated Alkyl Substances，PFAS)被广泛应用于工业生产和人类消费，包括全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane Sulfonate，PFOS)，全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid，PFOA)，全氟丁基磺酸(Perfluorobutane Sulfonate，PFBS)等。该类化合物大量使用致使其以各种途径进入全球范围内各种环境介质如水体、土壤、大气中，并通过食物链传递放大生物效应，目前在人体以及许多动物组织中均发现浓度较高PFOS和PFOA存在。这类化合物在自然环境和生物体内具不分解性和很高的生物积累能力，其所造成的全球性生态污染已成事实，这是直接关系到人类健康的重要问题。已有文献报道PFOS具有发育毒性、生殖毒性、心血管毒性、神经毒性等多重毒性效应，被认为是一类具有全身多脏器毒性化合物。虽然研究者已经掌握了一些关于PFOS发育毒理学研究资料，但还处于初始阶段，且多限于动物实验。PFOS引起的发育毒性作用机制和敏感指标还远未完全清楚。氨基酸进行稳定同位素标记(Stable Isotope Labeling with AminoAcidsin Cell Cultures，SILAC)是近年来发展起来的比较蛋白组学新方法，可以对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性、定量鉴定分析，快速找出重要功能蛋白质。目前尚未见利用EST系统预测全氟烷基化合物对心肌发育毒性作用研究报道，也未见利用SILAC标记定量蛋白质组学技术研究该类化合物毒性作用机制，亟待深入探索加以论证。
　　 基于上述背景，本学位论文主要利用EST模型从细胞毒性、分化抑制、基因蛋白表达不同水平系统论证全氟烷基系列化合物PFOS、PFOA和PFBS心肌发育毒性作用强弱等级及构效关系。为进一步重点考察PFOS对心肌发育毒性作用的具体分子机制，我们采用SILAC标记的蛋白组学方法定量研究PFOS干预ES细胞定向分化心肌细胞前后差异表达蛋白图谱。采用GO分类方法探讨差异蛋白的细胞位置、基因参与的生物过程、发挥的分子功能，通过Pathway分析PFOS对不同通路的影响，通过Network分析差异基因的网络互作关系，并采用Western Blot法对差异蛋白予以验证。研究结果将有利于揭示PFOS引起心肌发育毒性作用的早期分子事件和毒性敏感指标。同时有利于将EST作为一种有效的毒性评价体系在化合物成药性或环境毒物对心肌毒性预测性评估中的推广应用。
　　 目的：利用EST模型从细胞毒性、分化抑制、基因蛋白表达不同水平评价全氟烷基化合物PFOS、PFOA和PFBS对小鼠胚胎干(Mouse Embryonic Stem，mES)细胞定向分化为心肌细胞的发育毒性作用，分析该类化合物致心肌发育毒性的构效关系。并利用SILAC标记的定量蛋白质组学探讨PFOS致心肌发育毒性作用机制。
　　 方法：利用经典的悬滴培养法建立EST模型，加入不同浓度的青霉素、DPH、5-FU以及全氟烷基化合物PFOS、PFOA和PFBS，检测受试物对mES定向心肌分化能力的影响获得产生50％ mES细胞分化抑制作用的浓度ID50 D3；采用MTT法检测受试物对ES细胞和3T3细胞的细胞毒性获得产生50%细胞毒性作用的浓度IC50D3和IC503T3，经发育毒性计算公式计算，并依据发育毒性判定标准评定受试物的发育毒性等级，并分析全氟烷基化合物致心肌发育毒性构效关系。
　　 利用SILAC定量蛋白质组学技术考察PFOS干预ES细胞定向分化心肌细胞前后差异表达蛋白图谱，分别用含轻型稳定同位素(天然稳定同位素)和重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基，对mES分别进行培养，待细胞标记完全后(标记率90%以上)，将经过轻、重型同位素标记的两组细胞进行悬滴、悬浮、贴壁培养，设定轻型同位素标记细胞为溶剂对照组，重型同位素标记细胞用PFOS处理。化合物处理10天后收集样本，分别提取蛋白等比例混合后经SDS-PAGE分离，酶解提取肽，进行质谱检测，通过质谱图上每对轻重稳定同位素峰比例可反映对应蛋白在PFOS作用后的表达变化。根据每个鉴定蛋白至少包含两段鉴定多肽，且溶剂对照组(DMSO)和实验组(PFOS)差异1.5以上的标准来筛选差异蛋白。用Gene Ontology annotations软件对差异蛋白进行功能分类，通过网络数据分析以及文献查阅来确定差异蛋白的功能，揭示PFOS致心肌发育毒性部分作用靶标。
　　 基于蛋白组学的结果，选取了活性氧信号通路以及OCT4甲基化方面与PFOS心肌发育毒性作用的相关性进行了探讨。主要利用Western Blot方法和RT-PCR方法进行重要蛋白的验证。通过DCF-DA检测PFOS作用后拟胚体EBs内ROS含量。
　　 结果：通过EST模型评价了青霉素(Penicillin G)、苯妥英(Phenytoin，DPH)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)心肌发育毒性，三者IC50D3依次为6981、246和0.36μM，IC503T3分别为6370、240和0.45μM，ID50D3分别为4626、99和0.31μM，心肌发育毒性等级分别为一级、二级、三级，结果与文献报道一致，该模型通过有效性验证，适用于全氟烷基化合物PFBS、PFOA和PFOS心肌发育毒性评价。受试化合物PFBS、PFOA和PFOS的IC50D3依次为4139、470和291μM，IC503T3分别为5980、484和435μM，ID50D3分别为808、223和40μM，心肌发育毒性等级分别为一级、二级、二级。三者心肌发育毒性强弱顺序为PFOS>PFOA>PFBS，且具有一定构效关系，即碳链越长心肌发育毒性越大，末端磺酰化心肌发育毒性大于未磺酰化。
　　 从形态上观察，PFOS作用ES细胞后，影响拟胚体(embryoid bodies，EBs)形态，浓度越大，EBs半径越小。RT-PCR检测结果显示，随着PFOS浓度增加，中胚层基因Brachury及心肌特异性基因α-MHC表达下降，且呈浓度依赖性。Western blot方法检测结果显示，PFOS使心肌特异性转录因子GATA4、MEF2C呈浓度依赖性表达下调。流式细胞术定量检测PFOS使表达心肌特异性蛋白α-actinin的心肌细胞数量呈浓度依籁性下调。
　　 SILAC标记蛋白质组学分析结果显示，PFOS作用后与溶剂对照组比较，mES分化为心肌细胞蛋白质表达图谱存在明显差异。共筛选出176个差异蛋白，PFOS作用后67个蛋白上调和109个蛋白下调。对差异蛋白进行GO分析显示，在分子功能方面有13个分类，在细胞定位方面有12个分类，在细胞生物学过程方面有10个分类。将差异蛋白对应基因进行KEGG通路分析，共筛选到31个统计学上有显著意义的信号通路，主要涉及参与信号转导、脂代谢、能量代谢及酶代谢相关通路。在网络分析图中，差异蛋白对应基因与基因组中其他基因的相互作用共涉及到118个蛋白1296个相互作用，其中与发育相关差异基因与其他基因的相互作用涉及32个蛋白469个相互作用。
　　 基于上述蛋白组学结果，选取了活性氧信号通路以及OCT4甲基化方面探讨相关毒性作用机制。对差异蛋白Dnmt3b、Dnmt3a、SOD2、Hsp27、MYH10及其相关蛋白进行验证，PFOS作用后Dnmt3b、Dnmt3a蛋白表达呈下调趋势，Dnmt3b在第3、5、6d均有明显下调，而Dnmt3a在第6d明显下调，而OCT4在第5、6d上调。PFOS使SOD2、Hsp27上调，SOD在第3、5d上调明显，Hsp27的磷酸化形式在全程均成上调趋势，致使在心肌分化过程中ROS减少，导致ERK1/2、p38MAPK磷酸化降低，进而使下游GATA4、MEF2C、α-MHC、α-actinin、MYH10表达下调。
　　 结论：
　　 1.基于EST体系测得PFOS、PFOA、PFBS心肌发育毒性分别为二级、二级、一级，心肌发育毒性强弱顺序为PFOS>PFOA>PFBS，构效关系为碳链越长心肌发育毒性越大，末端磺酰化心肌发育毒性大于未磺酰化。
　　 2.通过SILAC标记的定量蛋白组学构建了PFOS对ES细胞定向分化为心肌细胞蛋白质差异表达图谱，通过质谱共鉴定出176个差异蛋白，其中67个蛋白上调和109个蛋白下调。差异蛋白涉及31个生化和信号通路，蛋白质相互作用网络图中共包含118个蛋白1296个相互作用。
　　 3.PFOS持续作用使清除活性氧相关蛋白SOD2、Hsp27表达增加，EBs中ROS含量降低，致使p38MAPK通路活化受阻，从而抑制心肌分化。另一方面，PFOS可使DNA甲基转移酶下调，致使OCT4沉默受阻，从而抑制了ES细胞的分化启动进程。