蛋白激酶A锚定蛋白Cypher在心脏中的功能及机制研究

摘要

1.目的和意义：
　　蛋白激酶A又称cAMP依赖型蛋白激酶A(cyclic-AMP dependent protein kinaseA)，在细胞信号调控中发挥重要功能，参与生物体糖原及脂类代谢的调控。在心肌细胞中，PKA的磷酸化作用对心肌收缩、代谢、离子流、基因表达等生理过程的调节十分重要。蛋白激酶A全酶由两个催化亚基（C亚基）和两个调节亚基(R亚基)组成，全酶在cAMP低水平时，以异源四聚体形式存在。肾上腺素受体活化增加细胞中的cAMP的含量，cAMP与调节亚基结合，改变调节亚基构象，使调节亚基和催化亚基解离，释放出催化亚基。活化的蛋白激酶A催化亚基可使细胞内某些蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，进而发挥相关的生物学功能。
　　PKA发挥精细调控功能依赖于PKA锚定蛋白(A-kinase anchoring protein，AKAP)，通过它将PKA与其底物聚集到特定的亚细胞区域，从而提高了磷酸化修饰的特异性以及信号转导的准确性，有效地整合cAMP信号通路中的上游活化因子和下游效应蛋白。目前在心脏中发现20多个AKAPs，它们组成一个调控网络共同调节心肌细胞的生理功能。PKA介导的Tropolin I，Myosin binding proteinC(MyBP-C)，Titin和Myosin light chain蛋白磷酸化和心肌细胞的收缩密切相关，目前心肌肌小节上发现的AKAPs有:Synemin、cTnT、Myospryn和Myomegalin，但具体的调控机制还未研究清楚。
　　Cypher基因（人的对应基因为ZASP）又称LDB3，其编码蛋白Cypher是PDZ-LIM结构域蛋白家族中的一员，主要在横纹肌中表达，位于肌小节的Z线上。心肌细胞定向敲除Cypher的小鼠发生了严重的扩张型心肌病(DCM)和心源性猝死。ZASP基因突变与心肌病、骨骼肌病相关，到目前为止ZASP基因中共发现16个突变位点，然而突变造成不同类型肌病的分子病理机制仍然不清楚。通过生物信息学分析发现Cypher的蛋白二级结构中存在两性螺旋，提示Cypher可能和PKA调节亚基结合。由此我们推测:Cypher不仅仅作为骨架蛋白，参与心肌的收缩，而且它还参与了PKA信号在心肌细胞中的调控作用。揭示Cypher与PKA的关系将有助于拓宽我们对于心肌病发病机制的认识，并为心肌病的治疗引入潜在的新靶点。
　　2.研究方法：
　　首先采用生物信息学方法分析Cypher的二级结构，发现存在两性螺旋。为了验证此结果我们体外过表达带标签的蛋白，然后用标签抗体亲和纯化的方法鉴定相互作用的蛋白及参与的氨基酸残基。同样的方法也用来验证Cypher和钙调磷酸酶(CaN)和L型钙通道(LTCC)的相互作用。采用体外PKA磷酸化与突变的方法相结合，确定了Cypher与LTCC上可能的PKA作用位点。在体内，利用Cypher敲除小鼠研究了Cypher敲除对LTCC，PKA蛋白表达的影响，以及肾上腺素刺激下野生型小鼠与Cypher敲除小鼠中LTCC的PKA磷酸化水平的差异。最后利用免疫共沉淀和酶活试剂盒检测CaN的酶活。
　　3.研究结果：
　　3.1 Cypher1c、2c、CCSR都能和PKA调节亚基RⅡα结合;两性螺旋结构域中的氨基酸突变后与PKA调节亚基RⅡα的结合显著降低;同时Cypher结合于PKA调节亚基RⅡα中的D/D结构域。
　　3.2 ZASP/Cypher中与心肌病相关的T206I突变体与PKA调节亚基RⅡα的结合作用增强。
　　3.3 Cypher中265和296两个位点的Ser突变成Ala显著降低PKA对Cypher的磷酸化水平。
　　3.4 Cypher依赖PDZ结构域结合于L型钙离子通道的C端，在HEK293细胞和心肌细胞中Cypher都可以增强PKA对L型钙离子通道的磷酸化作用，并且该调节作用是依赖于Cypher的PDZ结构域。β肾上腺素受体活化后，Cypher敲除小鼠中L型钙离子通道的PKA磷酸化水平明显低于野生型小鼠。
　　3.5 Cypher能够与Calcineurin结合，并结合区位于Calcineurin的酶催化活性区。与野生型小鼠相比，Cypher敲除小鼠中Calcineurin的酶活性显著增强。
　　4.结论：
　　4.1 Cypher是一个典型的Ⅱ型AKAP，Cypher与PKA调节亚基结合是基于Cypher的两性螺旋结构域，Cypher结合于PKA调节亚基的D/D结构域。病理性点突变T206I的分子机制可能是增强了ZASP/Cypher与PKA调节亚基的结合。
　　4.2 Cypher是PKA的底物，Cypher中265和296两个位点可以被PKA磷酸化。
　　4.3 Cypher可以增强PKA对L型钙离子通道的磷酸化作用，并且该调节作用是依赖于Cypher的PDZ结构域。
　　4.4 Cypher可以和Calcineurin结合，对Calcineurin的酶活有抑制作用。