长链脂肪酸对乳鸽肠道发育及营养物质代谢调控的机理研究

摘要

本研究以美国王鸽为试验对象，首先在构建体外培养模型的基础上，比较了不同碳链长度和饱和度的长链脂肪酸对美国王鸽脂肪酸转运蛋白、胃肠肽和神经递质合成酶基因表达以及肠道细胞增殖与凋亡的影响，并进一步通过体内实验，在亲鸽饲料中添加不同脂肪源研究了其对乳鸽肠道发育和养分代谢的影响，综合体内外实验初步探讨了脂肪酸对鸽肠道发育及营养物质代谢的作用机理。
　　 试验一长链脂肪酸对美国王鸽脂肪代谢相关基因表达的影响
　　 利用cDNA末端快速克隆技术(RACE-PCR)得到了美国白羽王鸽脂肪酸转位酶(FAT/CD36)、肠型脂肪酸结合蛋白(Ⅰ-FABP)、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）四个基因的全序列。结果显示:FAT/CD36基因全序列长度为2282bp共编码471个氨基酸;Ⅰ-FABP基因全序列为855bp编码132个氨基酸;PPARα基因全长为1941bp共编码468个氨基酸;PPARγ基因全序列为1653bp共编码475个氨基酸。多重序列比较发现美国王鸽四个脂肪代谢相关基因均与其它鸟类对应的基因具有高度的相似性。荧光定量分析结果显示，美国王鸽FAT/CD36和Ⅰ-FABP基因在十二指肠和空肠段从胚胎期第11天至出壳后第28天内mRNA丰度不断升高，前者在十二指肠和空肠中分别于第28天和第14天达到最高(P＜0.05)，后者在十二指肠和空肠中均于第28天达到峰值。然而王鸽FAT/CD36基因在回肠段随发育的进行表达量未表现出规律性，且Ⅰ-FABP基因在回肠段仅于出壳时表达量达到最大值（P＜0.05），随后逐渐降低并最终恢复至胚胎期水平。PPARα基因在在肾脏组织中表达量最高，而PPARγ基因在脂肪组织中表达量最高。体外实验结果显示5μM的油酸、棕榈酸和亚油酸能够显著升高FAT/CD36和PPARγmRNA水平(P＜0.05)，但是对于亚麻酸和花生四烯酸而言，引起基因表达变化需要更高的浓度（50μM或250μM），Ⅰ-FABP的mRNA水平能够被亚油酸和花生四烯酸显著提高（P＜0.05），但油酸和亚麻酸对其基本无影响（P＞0.05），5μM棕榈酸或50μM油酸显著降低PPARαmRNA水平(P＜0.05)，亚麻酸对PPARα基因表达量无显著影响(P＞0.05)。结果提示长链脂肪酸作用下鸽肠道FAT/CD36基因表达可能受到PPARγ途径调控，而Ⅰ-FABP基因表达主要受到n-6多不饱和脂肪酸的影响。
　　 试验二长链脂肪酸对美国王鸽胃肠道神经肽及神经递质合成酶基因表达的影响
　　 利用cDNA末端快速扩增(RACE)法克隆了美国王鸽生长激素释放肽Ghrelin、胆囊收缩素CCK以及神经型一氧化氮合成酶nNOS的全部和部分序列，并采用荧光定量PCR检测了三种基因在美国王鸽肠道的发育表达规律以及油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸和花生四烯酸五种长链脂肪酸对三种基因表达的影响。RACE结果显示:美国王鸽Ghrelin基因全长为800bp共编码116个氨基酸;CCK基因全序列为739bp共编码130个氨基酸;另外，本实验还克隆得到了nNOS基因的部分序列为835bp。荧光定量PCR结果显示:Ghrelin和nNOS基因表达量在十二指肠、空肠和回肠均于出壳后的第8天达到最大值(P＜0.05)。CCK基因在十二指肠和回肠中均于出壳后第8天表达量达到最高值，而在其它日龄时期均不显著（P＞0.05）。CCK基因在空肠中的表达量则表现出随日龄增加而不断升高的趋势，且在乳鸽第28日龄达到最高值（P＜0.05）。体外实验结果显示:与对照组相比，5μM的油酸和高浓度（50和250μM）的亚油酸、亚麻酸以及花生四烯酸均使美国王鸽胚胎期空肠Ghrelin基因表达量显著提高（P＜0.05），而棕榈酸各浓度处理组的Ghrelin基因表达量无明显变化(P＞0.05)。5μM的亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸和250μM的棕榈酸处理组美国王鸽空肠段CCK基因表达量显著下降，而高浓度250μM的油酸和亚麻酸处理组CCK基因表达量显著上升（P＜0.05）。此外，5μM的亚油酸、亚麻酸和棕榈酸处理组以及250μM的油酸和亚麻酸处理组nNOS基因表达量显著降低(P＜0.05)。综上所述，美国王鸽Ghrelin、CCK以及nNOS可能在美国王鸽乳鸽消化道发育早期起重要作用，且三个基因对脂肪酸的响应机制可能存在不同于哺乳动物的特殊作用途径
　　 试验三长链脂肪酸对美国王鸽肠道细胞增殖与凋亡的影响
　　 本实验以美国王鸽胚胎期肠道器官培养为模型，研究了长链脂肪酸（油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸和花生四烯酸）对肠道细胞增殖与凋亡的影响。结果显示:油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸均能显著提高美国王鸽胚胎期空肠细胞增殖率(P＜0.05)，而棕榈酸各浓度处理组细胞增殖率无明显变化(P＞0.05)。生长激素释放肽(Ghrelin)受体拮抗剂GHR-6能够显著降低由油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸诱导的细胞增殖率并使其恢复至对照组水平。另外，除棕榈酸外，其余四种脂肪酸处理组美国王鸽空肠段Bcl-2和Bax基因表达比值与对照组相比显著升高（P＜0.05）。在Tunel实验中，肠道器官培养液中添加油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸均能有效抑制细胞的凋亡(P＜0.05)，其中添加5μM花生四烯酸效果最为明显，而棕榈酸处理组与对照组相比却显著提高凋亡率(P＜0.05)。同时，在培养液中添加Ghrelin受体拮抗剂GHR-6与一氧化氮NO供体硝普钠SNP分别有升高和降低凋亡率的趋势，但差异不显著(P＞0.05)，而添加nNOS抑制剂L-NAME后肠道细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)。以上结果提示:油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸能有效促进空肠细胞的增殖并抑制其凋亡，而棕榈酸促进肠道细胞的凋亡。作者推测不饱和脂肪酸可能是通过生长激素释放肽Ghrelin途径影响细胞的增殖，以及通过影响凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达和神经型一氧化氮合成酶nNOS活性途径进而调控细胞的凋亡。
　　 试验四不同脂肪源对美国王鸽乳鸽生长性能和肠道发育的影响
　　 实验共采用240对美国王鸽亲鸽（公母各半），随机分成4个处理组，每个处理组6个重复，每个重复10对亲鸽。480只1日龄出壳幼鸽被随机分配，每两只幼鸽由一对亲鸽饲喂。亲鸽饲粮在基础日粮上分别添加3％的猪油、棕榈油、豆油或鱼油。研究结果表明:鱼油处理组乳鸽28日龄体重较其它三组显著降低（P＜0.05）。豆油处理组乳鸽十二指肠绒毛高度和绒毛表面积均高于其它三组（P＜0.05），猪油组乳鸽空肠绒毛高度和隐窝深度显著升高(P＜0.05)，棕榈油组回肠绒毛高度和隐窝深度显著升高。在亲鸽饲粮中添加鱼油能够提高乳鸽空肠内容物中脂肪酶活性，而添加豆油则能提高十二指肠粘膜中碱性磷酸酶活性(P＜0.05)。与豆油组相比，棕榈油处理组乳鸽十二指肠、空肠和回肠粘膜的亮氨酰氨基肽酶活性分别降低了54.2％、40.1％和53.1％。猪油处理组乳鸽结直肠内四类细菌enteric group、Clostridium、Bifidobacterium、Coriobacterium和Bacteroides-Porphyromonas-Prevotella-group含量均最高(P＜0.05)。由此说明，亲鸽饲粮中添加鱼油降低了乳鸽的体重，而豆油较其它三种油脂对乳鸽绒毛形态和消化功能表现出更加有益的效果，因此建议在亲鸽饲粮中添加豆油可促进乳鸽的生长发育。
　　 试验五不同脂肪源对美国王鸽乳鸽营养物质代谢的影响
　　 不同脂肪源对美国王鸽28日龄乳鸽血清脂肪代谢相关指标影响显著，其中猪油处理组乳鸽血清高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、游离脂肪酸、甘油三酯以及总胆固醇含量均显著高于鱼油处理组(P＜0.05)。猪油和棕榈油处理组乳鸽胸肌脂肪和胆固醇含量显著高于鱼油处理组，豆油处理组胸肌中棕榈酸C16∶0、棕榈一烯酸C16∶1、油酸C18∶0、亚油酸C18∶1含量均显著低于猪油组和棕榈油组(P＜0.05)，而亚油酸C18∶2n-6、亚麻酸C18∶3n-3、二十碳一烯酸C20∶1n-9和二十碳二烯酸C20∶2n-6含量则显著高于猪油处理组和棕榈油处理组（P＜0.05），而鱼油处理组乳鸽胸肌中二十碳以上的不饱和脂肪酸除花生四烯酸C20∶4n-6外其它组分含量在四个处理组中均最高。另外，GC-MS结果显示鱼油处理组乳鸽肝脏匀浆液中甘氨酸、丙酸、磷酸和十五烷含量显著升高，而胆固醇含量较其它三组显著降低（P＜0.05）;豆油处理组代谢组分中葡萄糖、甘露糖、肌醇以及嘧啶含量显著升高(P＜0.05)，由此提示这9种物质可作为鸽饲料中添加脂肪时检测肝脏代谢的生物小分子标志物。

目录

声明

致谢

摘要

主要英文缩写词

第一章 文献综述

第一节 长链脂肪酸概述

1．长链脂肪酸的分类

2．长链脂肪酸的转化

第二节 长链脂肪酸在动物体内的吸收代谢特征

1．与长链脂肪酸转运相关的载体蛋白

2．家禽脂肪代谢特征

第三节 长链脂肪酸的生物学功能

1．对炎症反应的影响

2．对心血管功能的影响

3．对动物产品品质的影响

4．对肠道功能的影响

5．其它功能

第四节 胃肠道神经递质及其功能

1．胃肠道神经系统的结构

2．胃肠道神经递质

3．胃肠道神经递质的功能

4．营养物质对胃肠道神经递质分泌的影响

第五节 本研究的背景、目的、意义及主要研究内容

5．1 研究背景

5．2 本研究的目的和意义

5．3 本研究的主要内容

第二章 长链脂肪酸对美国王鸽脂肪酸代谢相关基因表达的影响

第一节 美国王鸽长链脂肪酸代谢相关基因FAT／CD36、I-FABP和过氧化酶体增殖物激活受体PPARα及PPARγ基因全序列的克隆与表达

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 数据处理

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第二节 美国王鸽胚胎期小肠器官体外培养方法的建立

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 数据处理

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第三节 长链脂肪酸对美国王鸽FAT／CD36、I-FABP、PPARα和PPARγ基因表达的影响

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 数据处理

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第三章 长链脂肪酸对美国王鸽胃肠道神经肽及神经递质合成酶基因表达的影响

第一节 美国王鸽肠道生长激素释放肽Ghrelin、胆囊收缩素CCK及神经型一氧化氮合成酶nNOS基因的克隆

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 结果与分析

1．4 讨论

第二节 美国王鸽肠道生长激素释放肽Ghrelin、胆囊收缩素CCK及神经型一氧化氮合成酶nNOS基因在肠道时空表达规律的研究

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 数据处理

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第三节 长链脂肪酸对美国王鸽肠道生长激素释放肽Ghrelin、胆囊收缩素CCK及神经型一氧化氮合成酶nNOS基因表达的影响

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 数据处理

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第四章 长链脂肪酸对美国王鸽肠道细胞增殖与凋亡的影响

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 数据处理

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第五章 不同脂肪源对美国王鸽乳鸽生长性能和肠道发育的影响

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 数据处理

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第六章 不同脂肪源对美国王鸽乳鸽营养物质代谢的影响

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 数据处理

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第七章 小结、创新点及研究展望

1．小结

2．创新点

3．研究展望

参考文献

博士期间论文发表情况