异源六倍体油菜小孢子培养及其DH群体、SSR遗传图谱的构建

摘要

通过芸薹属种间杂交，合成了异源六倍体新材料（包含芸薹属A、B、C三个基因组），由于其形态特征与四倍体油菜相似，暂且将它称为六倍体油菜。本研究将这些六倍体油菜相互杂交获得F1代，对其植株进行细胞学、农艺性状等相关分析。以甘蓝型油菜为材料对小孢子培养相关技术进行探索研究，并对能稳定遗传的六倍体油菜F1代植株进行游离小孢子培养和染色体加倍，建立了稳定优良的DH(Doubled haploid)群体，再结合SSR分子标记构建遗传图谱。取得主要研究结果如下: 1、甘蓝型油菜小孢子培养的细胞学观察。本研究对甘蓝型油菜品种(ZS758和ZS72)进行小孢子分离和培养，观察小孢子胚胎发育过程，探索小孢子胚胎发生与植株再生影响因素，并进行秋水仙碱加倍处理及倍性检测。结果表明，热激一天小孢子膨大细胞液泡消失，细胞核转移到细胞中央。第一次分裂为对称分裂的细胞是具有胚性的。对游离小孢子进行不同浓度（100、200和300 mg·L-1）的秋水仙碱溶液暗处理，当浓度为200 mg·L-1时加倍率较高。利用FCM(Flowcytometry)和FDA(Fluorescein diacetale)进行再生植株的倍性检测。 2、PEG(Polyethylene glycol)代替蔗糖作为渗透调节剂的小孢子培养技术。利用PEG6000作为渗透调节剂对甘蓝型油菜品种(ZS758和ZS72)进行游离小孢子培养。以NLN-13培养基为对照，结果表明，NLN培养基中含PEG6000浓度为6.25％时两个品种的出胚率最高，利用PEG培养得到的小孢子植株再生能力和自发加倍率高于对照，且不同PEG6000浓度下得到的小孢子胚状体逆境生理指标随浓度的增加而增加。 3、六倍体油菜细胞学特征与杂交F1代农艺性状特性。对六倍体油菜细胞学与形态学特性及杂交后代F1的细胞学特性和农艺性状表现进行分析。结果表明，86个六倍体油菜中有18个植株的染色体数目为54条。将其相互杂交获得了100个F1杂交后代。真杂交种的花粉活力水平在3％到97％之间。每个杂交组合的平均花粉活力在6％到68％之间。选取67个遗传稳定、农艺性状表现较好的F1杂交后代进行后续研究。 4、用于构建DH群体的六倍体油菜F1代的细胞学及稳定性分析。针对67个农艺性状表现较好的F1代植株进行染色体数目观察。结果表明，4个F1代植株被优先考虑作为构建DH群体的供体植株:H08-1(Li×Cowling)、H11-2(Li×Cowling)、H16-1(Meng×Yan)和H24-1（Yan×Li）。对这4个F1植株的花粉母细胞减数分裂Ⅰ和Ⅱ时期进行染色体配对观察，H11-2的花粉母细胞正常配子产生率最高可达70％，H16-1最低为36％。 5、六倍体油菜F1代植株小孢子培养、胚状体发生、植株再生和DH群体构建。对4个F1后代（H08-1、H11-2、H16-1和H24-1）进行游离小孢子培养、胚状体的分化与植株再生以及再生植株倍性检测。通过流式细胞仪检测H11-2和H16-1均产生了大于200个DH植株，而H08-1和H24-1都少于25株。 6、六倍体油菜SSR标记的多态性分析及连锁遗传图谱构建。利用六倍体油菜亲本对341对SSR引物进行多态性筛选，选取H16-1的DH后代作为构建遗传图谱的DH群体，结果表明，223对多态性标记对DH群体进行多态性分析，91个BoGMS、100个BrGMS以及37个SJ、SA和SB标记位点能够成功的整合到遗传连锁图中，构成了一个包含27个遗传连锁群(N1-N27)，长度为2131.4cM，两个位点间的距离为9.35cM的连锁遗传图。

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缩略词表

摘要

第一章 文献综述

1．1 芸薹属植株小孢子培养及双单倍体群体构建的研究进展

1．1．1 游离小孢子培养的机理

1．1．2 小孢子胚胎发生的影响因素

1．1．3 小孢子胚状体分化与植株再生过程中的影响因素

1．1．4 小孢子培养的染色体加倍与再生植株的倍性鉴定

1．1．5 小孢子培养的细胞形态学研究进展

1．1．6 小孢子培养的问题

1．1．7 双单倍体群体的获得及应用

1．1．8 小孢子培养及双单倍体群体的前景与展望

1．2 芸薹属植物种间杂交的研究进展

1．2．1 芸薹属A、B和C基因组之间的关系

1．2．2 芸薹属植物种间杂交的途径

1．2．3 芸薹属植物种间杂交在生产上的应用

1．2．4 芸薹属植物种间杂交的研究进展与发展前景

1．3 植物多倍体育种研究进展

1．3．1 获得多倍体的途径

1．3．2 多倍体植物的鉴定

1．3．3 多倍体具有的优点

1．3．4 多倍体在生产上的应用

1．3．5 多倍体用于育种的前景及展望

1．4 作物遗传图谱构建的研究进展

1．4．1 图谱构建的理论及统计学原理

1．4．2 作图群体的选择

1．4．3 遗传作图中的标记技术

1．4．4 遗传作图的数据分析方法与统计学原理

1．4．5 芸薹属植物遗传图谱的研究进展

1．5 本研究的目的与意义

第二章 甘蓝型油菜小孢子培养的细胞学研究

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 试验材料

2．2．2 小孢子分离和培养

2．2．3 小孢子培养过程中的细胞学观察

2．2．4 小孢子培养过程中细胞的超显微结构观察

2．2．5 胚分化与植株再生

2．2．6 数据分析

2．2．7 再生植株的倍性分析

2．3 结果与分析

2．3．1 小孢子细胞的生活力

2．3．2 小孢子培养过程中的细胞学观察

2．3．3 小孢子培养过程中细胞的超显微结构观察

2．3．4 不同浓度秋水仙碱的加倍效果

2．3．5 利用流式细胞仪和FDA染色法检测小孢子植株倍性水平

2．4 讨论

第三章 聚乙二醇(PEG)代替蔗糖作为渗透调节剂的小孢子培养技术

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料和试剂

3．2．2 PEG作为渗透调节剂的小孢子分离和培养

3．2．3 PEG胁迫下产生的小孢子胚状体各生理指标的测定

3．2．4 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 不同浓度PEG作为渗透调节剂的小孢子出胚率

3．3．2 不同浓度PEG作为渗透调节剂的小孢子再生与自发加倍能力

3．3．3 不同浓度PEG作为渗透调节剂的小孢子生理特性

3．4 讨论

第四章 六倍体油菜细胞学特征与杂交F1代农艺性状特性

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 试验材料

4．2．2 有丝分裂时期染色体数目观察

4．2．3 SSR分子标记鉴别真杂交种

4．2．4 花粉活力观察

4．3 结果与分析

4．3．1 六倍体油菜的细胞学与形态学特性

4．3．2 真杂交种的鉴定及其细胞学特性

4．3．3 F1杂交后代在温室中的农艺性状表现

4．4 讨论

第五章 用于构建DH群体的六倍体油菜杂交F1代细胞学性状及稳定性分析

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 试验材料

5．2．2 有丝分裂时期染色体数目观察

5．2．3 花粉活力观察

5．2．4 减数分裂时期花粉母细胞染色体行为观察

5．2．5 数据分析

5．3 结果与分析

5．3．1 六倍体油菜F1代植株染色体数目观察

5．3．2 六倍体油菜F1代植株花粉活性观察

5．3．3 构建六倍体油菜遗传图谱的DH群体F1代供体植株的筛选

5．3．4 作为供体植株的六倍体油菜F1代减数分裂时期染色体行为

5．4 讨论

第六章 六倍体油菜F1代植株小孢子培养、胚状体分化、植株再生和DH群体构建

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 试验材料

6．2．2 小孢子分离与培养

6．2．3 胚状体的分化与植株再生

6．2．4 再生植株倍性检测

6．2．5 双单倍体植株的移栽、套袋与种子收获

6．2．6 数据分析

6．3 结果与分析

6．3．1 供体F1植株小孢子胚胎发生率和再生率

6．3．2 供体F1植株再生植株加倍率

6．3．3 筛选杂交后代小孢子来源的DH后代作为构建图谱的作图群体

6．4 讨论

第七章 六倍体油菜SSR标记的多态性分析及连锁遗传图谱的构建

7．1 引言

7．2 材料与方法

7．2．1 试验材料

7．2．2 DH群体的构建与筛选

7．2．3 亲本和DH群体基因组DNA的提取及质量和浓度检测

7．2．4 SSR引物来源

7．2．5 SSR分析

7．2．6 亲本对SSR引物多态性筛选及多态性标记在DH群体中的分离

7．2．7 数据处理

7．3 结果与分析

7．3．1 亲本和DH群体基因组DNA的制备

7．3．2 亲本对SSR引物多态性筛选及多态性标记在DH群体中的分离

7．3．3 图谱特性分析

7．3．4 标记在不同连锁群上的分布情况

7．3．5 根据标记数据分析染色体缺失及DH群体稳定性

7．3．6 相同标记在不同图谱上的分布

7．4 讨论

第八章 结论与展望

8．1 研究结果与创新点

8．2 研究展望

参考文献

附录 博士期间发表论文与专利情况