灰霉病菌中2C型丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PTCs)及酪氨酸磷酸酶(PTPs)的功能研究

摘要

由激酶及磷酸酶催化的蛋白磷酸化与去磷酸化反应参与了生物体的多个代谢过程。真核生物蛋白的磷酸化位点主要有丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸残基，因此，相应的去磷酸化过程是由丝氨酸/苏氨酸磷酸酶或酪氨酸磷酸酶催化完成。2C型丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PP2Cs)及酪氨酸磷酸酶(PTPs)是十分重要的两类磷酸酶，参与调控生物体内的多个生命活动过程，但是，目前这些磷酸酶在丝状真菌中的研究仍然处于起步阶段。
　　 灰霉病菌(Botrytis cinerea)的基因组中存在5个2C型丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PP2Cs)基因（命名为BcPTC1，-3，-5，-6和-7）和两个酪氨酸磷酸酶基因(BcPTPA和BcPTPB)。本文通过基因敲除及回补的方法研究了这些基因的生物学功能，结果发现，BcPTC5，BcPTC6和BcPTC7基因突变体的表型与野生型相比变化不明显，但是另外4个基因(BcPTC1，BcPTC3，BcPTPA和BcPTPB)的突变体的表型与野生亲本菌株相比发生了显著变化:1）四个基因突变体均不能产生菌核，除BcPtpB突变体以外，另三个基因突变体的生长速率明显下降。2）BcPtpA突变体的分生孢子数目显著减少，而其它三个基因突变体的分生孢子产生量明显增多。3）这四个基因敲除体的黑色素合成均显著增加。4）四个基因的敲除突变体对渗透压力(NaCl和KCl)、氧化压力(H2O2)、DCFs药剂(iprodione)及细胞壁损伤物质（刚果红、咖啡因及细胞壁降解酶）都表现一定程度的敏感。5)在酵母中Ptc1，Ptc3，Ptp2及Ptp3均可以负向调控HOG(high-osmolarityglycerol)及CWI(the cell wall integrity)信号途径，在灰霉病菌中只有BcPtc3是HOG信号途径的负调控元件;另外，BcPtc1和BcPtc3也可以正向调控灰霉BcBmp3（与酵母CWI信号途径中的Mpk1/S1t2同源）蛋白的磷酸化;与酵母中Ptp2/3作用不同，灰霉中两个酪氨酸磷酸酶BcPtpA和BcPtpB能够正向调控BcBmp3和BcSak1的磷酸化。6）四个基因的敲除突变体在黄瓜、油菜、番茄叶片，苹果等寄主上的致病力明显下降。这些结果表明，BcPtc1，BcPtc3，BcPtpA及BcPtpB在灰霉病菌的菌丝生长、分化、致病以及对适应外界胁迫中发挥重要作用。

目录

声明

致谢

摘要

引言

第一章 文献综述

1 灰霉病与灰霉病菌

1．1 灰霉病生物学概况

1．2 灰霉病害发生规律

1．3 灰霉病害防治

2 双组份组氨酸信号途径

2．1 原核生物的两组分系统：His-Asp

2．2 真核生物的两组分系统：His-Asp-His-Asp

3 蛋白磷酸酶研究进展

3．1 PP2C磷酸酶的结构与功能

3．2 酪氨酸磷酸酶

4 本研究的目的和内容

第二章 材料与方法

1 试验材料

1．1 菌株和质粒

1．2 供试植物

2 试验方法

2．1 灰霉菌种的保存与培养

2．2 灰霉基因组DNA的提取

2．3 PCR技术

2．4 DNA的琼脂糖电泳

2．5 PCR产物纯化

2．6 DNA克隆技术

2．7 E.Coli DH5α感受态细胞的制备及转化

2．8 重组质粒的鉴定与提取

2．9 质粒酶切

2．10 农杆菌电击法转化

2．11 灰霉病菌T-DNA转化

2．12 灰霉的原生质体转化

2．13 灰霉基因组DNA Southern blot分析

2．14 RNA提取与表达量分析

2．15 Western blot分析

2．16 酵母双杂交试验

2．17 菌丝甘油量测定

2．18 生长速率测定

2．19 产孢量分析

2．20 灰霉病菌抗胁迫压力的测定

2．21 灰霉病菌致病性分析

第三章 结果与分析

1 灰霉病菌中2C型丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PP2Cs)的功能研究

1．1 灰霉5个PTC的克隆和功能分析

1．2 5个PTC基因敲除载体的构建

1．3 灰霉PTC敲除转化子的获得

1．4 ΔBcPtc1，ΔBcPtc3突变体的互补

1．5 突变体表型分析

1．6 BcNbp2的功能鉴定

1．7 小结与讨论

2 灰霉病菌中酪氨酸磷酸酶(PTPs)的功能研究

2．1 BcPTPA及BcPTPB基因敲除载体的构建

2．2 BcPTPA及BcPTPB敲除突变体的获得

2．3 ΔBcPtpB突变体的互补

2．4 突变体表型分析

2．5 小结与讨论

3 灰霉病菌中BcSkn7的功能分析

3．1 BcSKN7的分析

3．2 BcSKN7回补酵母突变体

3．3 BcSKN7基因的克隆与敲除

3．4 ΔBcSkn7-1突变体的互补

3．5 突变体表型分析

3．6 小结与讨论

第四章 全文总结与展望

1 全文总结

1．1 BcPtc及BcPtp与菌体生长发育有关

1．2 BcPtc及BcPtp参与渗透、氧化压力敏感性调控

1．3 BcPtc及BcPtp调控BcSak1及BcBmp3磷酸化

1．4 BcPtc及BcPtp调控药剂敏感性

1．5 BcPtc及BcPtp与致病性相关

1．6 BcSkn7与菌体生长代谢相关

2 本研究创新点

3 后续研究展望

参考文献

附录

附录A：引物

附录B：培养基配方

附录C：常用试剂和试验仪器

附录D：个人简历和博士期间发表的学术论文