Dynamins在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制及Dynasore的保护作用

摘要

目的与背景:
　　近来发现线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开放和关闭在心肌缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury, IRI）中起到非常重要的作用，同时线粒体的形态和运动在很大程度上影响线粒体的功能，线粒体分裂蛋白(Drp1)可能在其中起到关键作用，但其具体作用机制尚未阐明。Dynasore是一种发动蛋白（Dynamin）抑制剂，主要抑制Dynamin1，Dynamin2和Drp1的GTP酶活性。目前，有关Dynasore的研究主要集中在细胞内吞方面，在心脏方面的研究几乎缺乏。我们在有关心肌细胞内吞的实验中发现加用Dynasore后细胞死亡率降低，推测Dynasore可能有心肌保护作用。但是Dynasore是否有明确的心肌保护作用，其可能的保护作用是否是通过影响线粒体的形态和功能而产生尚不明确，另外，在心肌IRI中Drp1和Dynamin2的作用也未明确。
　　方法:
　　我们用1μM、3μM、10μM浓度Dynasore事先干预原代分离的成年小鼠心肌细胞2小时，后加入H2O230分钟后测定细胞存活率和活力（TBE测定法），以及心肌细胞内ATP含量（cellTiter-Glo发光光度测定法）;测定Dynasore对非应激状态下HeLa细胞内ATP的影响;并在氧化应激状态下(H2O2)加入外源性ATP后测定心肌细胞存活情况（TBE测定法）;同时予1μM浓度Dynasore全程治疗(120分钟预治疗，30分钟缺血，60分钟再灌注)langendorff离体成年小鼠心脏，并测定其功能(LVESP、LVEDP、LVDP)、心肌梗死面积（PI测定法）及灌流液中TnI含量。在证实细胞内吞抑制浓度(1～10μM)以下的Dynasore对处于氧化应激状态的小鼠原代心肌细胞和IRI离体心脏均有心肌保护作用之后，进一步在乳鼠原代分离心肌细胞中观察线粒体的形态（MitoTracker(@) Mitochondrion-Selective Probes荧光探针，激光共聚焦显微镜），mPTP开放程度（TMRM测定膜电位推测开放程度，激光共聚焦显微镜）以及Drp1和Dynamin2的蛋白表达情况。进一步探讨Drp1和Dynamin2在心肌IRI中的作用机制，以及mPTP在其中的作用，并初步探讨Dynaosre对小鼠左室舒张末压的作用机制。
　　实验结果应用方差分析进行统计学处理。
　　结果:
　　我们的结果显示:(1)在langendorff灌注心脏，Dynasore组心肌梗死面积较对照组减少80％（分别为8.1％和39.6％，p＜0.001）;Dynasore组灌流液TNI浓度较对照组下降70％(p＜0.05)。(2)Dynasore组明显改善LVEDP(mmHg)（再灌注前与对照组基本接近，再灌注后15、30、60分钟与对照组分别为:4.6±3.7，3.3±4.3，0.0±4.8和21.6±3.7，25.2±6.6，24.9±4.8，p＜0.05），但不改变LVDP。(3)氧化应激导致心肌细胞的存活度和活力明显下降。而Dynasore明显提高细胞的存活度，并显著改善细胞的活力。(4) Dynasore增加存活的氧化应激心肌细胞内的ATP浓度(p＜0.05)，外源性ATP能起到和Dynasore相似的心肌保护作用。但低剂量的Dynasore（1μM～3μM）不影响非氧化应激下HeLa细胞内的ATP浓度，Dynasore的心肌保护作用的剂量明显低于其有效抑制细胞内吞的剂量。Dynasore这种细胞保护作用是呈剂量依赖性的，并在脱血浆状态下更明显。(5)空白组细胞加用30μMH2O2后，线粒体形态发生变化，网络化程度降低，融合过程受抑制，发生线粒体片断化;经1μM Dynasore预处理后心肌细胞线粒体形态与未经药物预处理的细胞组相似，线粒体分裂的速度高于融合速度，网络化程度降低，而3μM Dynasore预处理组的线粒体分裂程度相对较低;经10μM Dynasore预处理的心肌细胞基本维持了线粒体的网络状形态，与50μM Mdivi-1预处理的心肌细胞相似。(6)H2O2处理30分钟后，空白组细胞线粒体分裂，线粒体膜电位发生去极化，电位明显降低，大部分线粒体区域荧光消失;经过不同浓度Dynasore和Mdivi-1药物处理的细胞组，都呈现线粒体网状结构相对稳定。10μM Dynasore预处理心肌细胞组只有极少部分区域的荧光消失，而其他药物预处理组，荧光消失面积相对较大。(7)30μMH2O2可明显增强Dynamin2的蛋白表达，也增强Drp1的蛋白表达，加用10μMdynasore后明显降低Dynamin2和Drp1的蛋白表达，基本恢复到基线水平;而加用50μM Mdivi-1后Drp1和Dynamin2的蛋白表达较加用30μMH2O2时下降，但仍未恢复到基线水平。
　　结论:
　　(1)本研究在小鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型上，证实了Dynasore的心脏保护作用，包括改善心脏功能，减少心肌细胞死亡和心肌梗死面积。
　　(2)我们的研究第一次提出Dynasore对IRI心脏具有潜在的松弛作用。其机制可能是线粒体保护和氧化磷酸化的储存。
　　(3) Dynasore是通过抑制Drp1，减少线粒体片段化、分裂、改善线粒体膜电位Δψm、减轻mPTP的开放程度，从而发挥其心脏保护作用。
　　(4)抑制Dynamin2也可能对心脏起到一定的保护作用，但尚需做进一步研究。
　　(5)本研究加深了对心肌IRI机制的再认识，揭示了保护线粒体功能的药物治疗也许不仅仅有利于心肌细胞存活，也可能改善心脏舒张功能。

目录

声明

致谢

摘要

缩写／符号清单

1 绪论

1．1 心肌缺血再灌注损伤的概念及研究进展

1．2 线粒体通透性转换孔的概念、研究进展及与心肌缺血再灌注损伤

1．3 氧化应激与心肌缺血再灌注损伤及线粒体通透性转换孔的关系

1．4 Dynamins的概述和研究进展及Dynasore的药理作用

1．5 氧化应激与心力衰竭

1．6 研究目的、意义和方法

1．6．1 研究目的和意义

1．6．2 研究内容和方法

2 实验材料与方法

2．1 仪器

2．2 试剂和药物

2．3 研究对象

2．4 实验方法

2．4．1 小鼠心脏缺血再灌注离体实验流程图

2．4．2 实验动物分组、存活者随机分组

2．4．3 小鼠心脏缺血再灌注模型建立

2．4．4 血流动力学测定

2．4．5 灌流液标本留取和TNI检测

2．4．6 心肌组织标本留取和计算心肌梗死面积

2．4．7 原代分离小鼠心肌细胞实验流程图

2．4．8 实验分组

2．4．9 成年心肌细胞的分离培养

2．4．10 乳鼠心肌细胞的分离培养

2．4．11 成年心肌细胞存活度和活力测定

2．4．12 成年心肌细胞ATP测定

2．4．13 成年心肌细胞共聚焦显微镜测定存活细胞线粒体形态

2．4．14 乳鼠心肌细胞Mito Tracker工作浓度的摸索

2．4．15 乳鼠心肌细胞线粒体形态变化检测

2．4．16 乳鼠心肌细胞线粒体/ΔΨm变化程度检测

2．4．17 乳鼠心肌细胞WB检测Dynasore、Mdivi-1对心肌细胞Dynamin2和Drp1基因的蛋白表达变化

2．4．18 统计分析

3 实验结果

3．1 血流动力学结果

3．2 Dynasore减少心肌梗死面积

3．3 Dynasore降低灌流液TNI浓度

3．4 Dynasore减少心肌细胞损伤

3．5 Dynasore提高应激心肌细胞内ATP浓度

3．6 Dynasore抑制氧化应激诱导的HeLa细胞线粒体分裂

3．7 乳鼠心肌细胞成功分离图片

3．8 线粒体形态变化检测

3．9 线粒体ΔΨm变化程度检测

3．10 WB检测Dynasore、Mdivi-1对心肌细胞Dynamin2和Drp1基因的蛋白表达变化

4 附图

5 讨论

5．1 Dynasore减轻小鼠心脏缺血再灌注损伤

5．2 Dynasore保护小鼠心肌细胞线粒体形态和功能

5．3 Dynasore改善心肌细胞ATP储存和能量消耗

5．4 Dynasore减少心肌细胞Dynamin2和Drp1蛋白表达

5．5 在Langendorff小鼠灌注心脏，Dynasore保护缺血再灌注损伤后的病理性LVEDP升高

全文结论

参考文献

综述 氧化应激和心力衰竭

作者简历及在学期间所取得的科研成果