胃癌前病变癌变的动态监测:外周血微小RNA预警模型的建立及其应用

摘要

胃癌是全球恶性肿瘤死亡率的第二位，胃癌预后与诊断时期密切相关。但是目前临床上缺乏高敏感性和特异性的有效胃癌诊断分子标志物。寻找和验证新的胃癌变监测和早期诊断分子标志物，对胃癌诊断和早期治疗具有重要意义。
　　本研究通过胃癌、癌前病变、健康志愿者外周血样本miRNA测序发现了一组胃癌癌变相关的miRNA，通过聚类分析及统计学方法筛选出可能的胃癌相关差异表达miRNA，并通过qRT-PCR技术验证得到miR-331-3p和miR-197在胃癌、癌前病变、健康人外周血中存在明显差异表达。同时，我们通过Logistic回归方法建立的基于qRT-PCR检测分析的胃癌监测模型，并扩大样本对普通人群进行检测，发现miR-331-3p和miR-197在健康人、癌前病变患者、胃癌患者外周血中的表达呈不同变化走向，并能基本区分3类患者，证明联合检测miR-331-3p和miR-197可能具有对胃癌变过程进行监测，早期检测胃癌的重要价值。miR-331-3p和miR-197可能成为潜在的可用于临床的胃癌变监测和早期胃癌诊断的分子标志物。
　　研究步骤
　　1.胃癌外周血miRNA测序及分析
　　①第二代高通量测序分别检测6例胃癌患者、6例胃癌前病变患者、6例健康志愿者外周血样本miRNA表达图谱;
　　②将所有检测到的小RNA与各类RNA的比对、注释情况进行总结;
　　③对不同样品中表达的miRNA进行统计学分析，判断其在胃癌患者、胃癌前病变患者、健康志愿者间表达量是否存在显著性差异;
　　④预测可能与胃癌相关的新的miRNA。
　　2.胃癌外周血miRNA可能标志物的筛选及初步验证
　　①通过聚类分析及统计学方法筛选进一步验证胃癌外周血分子标志物的候选,miRNAs;
　　②利用实时PCR定量对6个候选miRNAs(miR-331-3p、miR-197、miR-23b*、miR-1260b、miR-3138、miR-3175)进行小规模初步验证（n=46，胃癌患者15例，胃癌前患者16例，健康志愿者15例）;
　　③根据实时PCR结果，初步确定miR197和miR331-3p为潜在的分子标志物，初步确定其判别胃癌的临界值。
　　④对可能miRNA分子标志物进行靶基因预测，预测其可能生物学功能。
　　3.胃癌前病变癌变诊断模型的建立及普通人群监测
　　①根据Logistic分析和qRT-PCR检测结果，构建miR197和miR331-3p胃癌检测模型，分析ROC曲线，确定检测敏感度和特异度。
　　②进行普通人群检测(n=302)，验证胃癌检测模型的检测效能，评估联合检测miR197和miR331-3p在胃癌变各阶段监测的价值。
　　②qRT-PCR检测分析miR197和miR331-3p外周血检测对胃癌(n=95)和其他肿瘤(n=20)的肿瘤特异性区分能力。
　　研究结果
　　1.外周血miRNA测序结果提示胃癌、癌前病交、健康人的外周血清中存在一组差异表达的miRNAs。
　　2.根据外周血miRNA测序结果，通过统计学分析，得到一组在胃癌、胃癌前病变及健康人之间可能存在差异表达的miRNAs: miR-331-3p、miR-197、miR-23b*、miR-1260b、miR-3138、miR-3175。
　　3.通过小规模qRT-PCR验证和统计学分析，明确mir-23b*、mir-197、 mir-331-3p在胃癌与非癌人群外周血中存在显著性差异表达。
　　4.通过Logistic回归方法建立了基于qRT-PCR检测分析的胃癌监测模型，并发现mir-197和mir-331-3p在区分癌与非癌时，具有较高的敏感度(74％)和特异度(72％)。
　　5.结合普通人群外周血的miRNAs分析，发现miR-331-3p和miR-197在健康人、癌前病交患者、胃癌患者外周血中的表达呈不同变化走向，其中胃癌组miR331-3p、miR-197表达同样具有明显差异性，但是区别在miR331-3p较癌前组表达更升高，而miR-197癌前组表达差异又可以将癌前与叫胃癌组和正常组做区分均明显升高。
　　6.小样本外周血的miRNAs分析显示，发现miR-331-3p和miR-197在胃癌患者和其他肿瘤患者外周血中不存在明显的表达差异。
　　7.生物信息学分析提示miR331-3p和miR197的靶基因与肿瘤细胞增殖、凋亡及细胞周期调控密切相关。
　　研究结论
　　1.通过外周血miRNA测序得到一组在胃癌、胃癌前病变及健康人之间具有差异表达的miRNA。
　　2.Mir-197和mir-331-3p在胃癌与非癌人群外周血中有明显差异表达。
　　3.通过Logistic回归对外周血miRNA分析，初步建立了胃癌变诊断模型:可能运用与普通人群胃癌/非胃癌判断，具有较高的敏感度和特异度，成为临床胃癌变早期检测的分子标志物。
　　4.联合检测miR-331-3p和miR-197可能具有对胃癌变过程进行监测，早期检测出胃癌。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩写一览表

引言

第一部分 胃癌外周血miRNA测序及分析

1．1 材料和方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 结论

第二部分 胃癌外周血miRNA可能标志物的筛选及初步验证

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

第三部分 胃癌前病变癌变诊断模型的建立及普通人群监测

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

参考文献

全文总结

综述 MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers in Gastric Cancer

个人简历