浙江省规模化猪场副猪嗜血杆菌分离株的耐药性及耐药基因分析

摘要

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)是猪Glasser's病的病原体，引起猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等，给养猪业造成巨大损失。抗生素对防控该病起到积极作用，但是由于抗菌素的不合理应用，造成副猪嗜血杆菌产生耐药性。本论文针对养殖场副猪嗜血杆菌感染的问题，对从浙江省一些规模化养殖场分离到的副猪嗜血杆菌进行抗生素的药敏试验，并分析了相关耐药基因，为养猪生产控制副猪嗜血杆菌病提供参考。
　　自2009年9月到2012年4月，从浙江省杭州、衢州、嘉兴、绍兴和金华等地区规模化猪场采集典型副猪嗜血杆菌感染病猪的肺、脾、胸腔液、腹腔液、关节液等病料。经实验室细菌学培养、分离、纯化、染色、PCR鉴定得到73株副猪嗜血杆菌菌株。采用K-B琼脂纸片法对73株复壮Hps浙江株进行了7类常用抗生素的敏感性试验。
　　结果显示:仅3株Hps对所有的抗生素敏感，5株只对一种抗生素耐药，65株至少对两种以上的抗生素具有抵抗能力，多重耐药菌株占比为89.04％。对磺胺类药物耐药的分离株比例高达86.30％，对四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、β-内酰胺类和氯霉素类抗生素耐药比例分别为65.75％、60.27％、50.68％、、50.68％和46.58％，对大环内酯类抗生素耐药为28.77％。Hps的耐药情况随着时间的变化而有所不同，Hps对β-内酰胺类的耐药率由70％下降到21％，对氯霉素类的耐药率由50％下降到26％，对磺胺类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖苷类的耐药率维持在40％以上，对大环内酯类的耐药率则维持在较低的水平。不同地区分离到的Hps的耐药谱也有较大的差异，自杭州、湖州、绍兴分离株最耐受磺胺类药物，而金华、嘉兴的分离株最耐受四环素类药物。
　　采用煮沸法提取Hps浙江株的DNA，作为PCR扩增模板。对文献中已报道的11个相关耐药基因Sul1、Sul2、TEM-11、Flor、CmlA、Cat1、TetA、TetB、 ErmB、Aac(6')-1b、AadA1进行PCR扩增，扩增产物经序列测定，并与GenBank中的相应耐药基因序列进行BLAST比对，吻合率达99％以上的确定为阳性。进一步计算Hps浙江株的耐药表型和基因型的符合率，以验证该基因是否跟耐药性相关。
　　结果显示:73个分离株中，97.26％的菌株中检测到耐药基因，多重耐药的占84.93％。喹诺酮类耐药基因Aac(6')-1b的检出率为76.71％，表型符合率为75.68％，提示Aac(6')-1b是Hps浙江株对喹诺酮类药物产生耐药性的主要耐药基因。氨基糖苷类耐药基因AadA1的检出率为65.75％，表型符合率为66.67％，提示AadA1是Hps浙江株对氨基糖苷类药物产生耐药性的主要耐药基因。耐磺胺类耐药基因Sul1的检出率(45.20％)高于SUL2的检出率(8％)，耐药表型符合率为62.07％，提示Sul1可能是猪源Hps浙江株对磺胺类药物耐药的主要基因。氯霉素类耐药基因Cat1的检出率(58.90％)高于Flor(15.07％)和CmlA(8.22％)，耐药表型的符合率达70％，提示Cat1是Hps浙江株对氯霉素类药物耐药的主要基因。四环素耐药基因TetB的检出率达(41.89％)高于TetA(4.11％)，耐药表型的符合率高达80.56％，进一步验证了TetB是介导Hps浙江株对四环素类药物产生耐药的主要耐药基因。β-内酰胺类耐药基因Tem-11的检出率为35.62％，表型符合率为74.29％，提示Tem-11是Hps对β-内酰胺酶类药物产生耐药性的主要耐药基因。耐大环内酯类耐药基因ErmB的检出率为1.37％。表型符合率为0，提示ErmB不是Hps浙江株对大环内酯类的主要耐药基因。
　　耐药基因的检出率随时间的不同有明显变化，携带耐β-内酰胺类药物耐药基因菌株的检出率由47％下降到26％，携带氨基糖苷类药物耐药基因菌株的检出率由75％下降到58％，携带耐氯霉素类耐药基因菌株的检出率由63％上升到79％，对耐四环素类、喹诺酮类耐药基因检出率未出现规律性变化。不同的地区分离的Hps菌株携带的耐药基因也是不同的，杭州、湖州、嘉兴和宁台温分离株中氯霉素类耐药基因检出率最高;金华、绍兴、嘉兴、衢州和宁台温分离株中喹诺酮类耐药基因检出率最高。
　　综上所述，浙江省规模化猪场副猪嗜血杆菌多重耐药现象较为普遍。检出了导致副猪嗜血杆菌耐药性产生的六个主要耐药基因，其主要耐药基因与其耐药性有较强的相关性，Ups浙江株耐药表型和携带的耐药基因具有时间性和地域性。本研究成果不仅为治疗浙江省规模化猪场的Glasser's病提供理论依据，还验证了Ups的分子耐药机制。

目录

声明

缩略词(Abbreviation)

摘要

第一部分 文献综述

1．1 副猪嗜血杆菌

1．1．1 病原的研究进展

1．1．2 形态及生理特性

1．1．3 菌体结构

1．1．4 血清型分型与毒力

1．1．5 诊断与防治

1．2 副猪嗜血杆菌的耐药性现状

1．3 细菌的耐药机制

1．3．1 细菌耐药性的产生机制

1．3．2 副猪嗜血杆菌携带的耐药基因

1．4 本研究的目的和意义

第二部分 研究内容

第一章 副猪嗜血杆菌浙江株的耐药表型分析

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果与分析

1．4 讨论

第二章 副猪嗜血杆菌浙江株耐药基因的检测分析

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三部分 主要结论

第四部分 创新点

参考文献

致谢