“核--壳”型诊断治疗系统的构建及其在肿瘤声动力--化疗联合治疗中的应用

摘要

肿瘤是危害人类生命健康的主要疾病之一，其治疗一直是医药研究领域的难题。影响治疗效果的原因主要有:载体的体内过程难以实时监测、肿瘤多药耐药(MDR)、载体靶向性不够等。为克服以上多种问题，多功能诊断治疗（Theranostics）系统开始出现，这种新型系统构建在纳米平台之上，整合利用多种技术，为肿瘤的监测及个体化治疗提供了可能。 本课题利用St(o)ber法构建了具有Fe3O4及NaYF4∶ Er3+/Yb3+核和TiO2壳的多功能纳米复合物（dual-core@shell nanocomposites，DCSNCs）。为进一步提高其稳定性及靶向效果，利用透明质酸(HA)对DCSNCs进行修饰构建了HA-DCSNCs。所制备的载体对阿霉素(DOX)具有良好的负载能力，并能实现pH梯度释放。此外，该载体还可实现磁靶向药物传递、体内实时成像、声动力治疗(SDT)多种功能。在实验过程中，我们还发现Fe3O4具有良好的光热性能，本研究同时也对该性能进行了系统的评价。 课题首先采用水热法制备了形状规则、分散性能良好的磁性Fe3O4纳米粒，并使用羧甲基壳聚糖(CMCTS)对其进行修饰(Fe3O4@CMCTS)，TEM、TGA及红外光谱结果证明CMCTS已成功包裹。采用MRI、紫外光谱研究了Fe3O4@CMCTS的横向弛豫率（r2）及吸光度等理化性质。以HAuNS作为参照考察了Fe3O4@CMCTS的体外光热效果及细胞毒性，结果表明，Fe3O4@CMCTS的光热性能与HAuNS相当，但Fe3O4@CMCTS毒性远低于Fe3O4@CMCTS。体外抗肿瘤效果显示，经过照射后Fe3O4@CMCTS可完全抑制肿瘤细胞的生长。体内注射后，MRI及活体成像研究表明Fe3O4@CMCTS可浓集于肿瘤部位，并可长时间维持较高浓度，808nm激光照射后，肿瘤部位温度升高至52℃C，肿瘤组织完全坏死。 第二，采用水热法合成了水溶性的Er3+/Yb3+及Tm3+/Yb3+掺杂的NaYF4∶Er3+/Yb3+与NaYF4∶ Tm3+/Yb3+上转换纳米粒，TEM结果表明，水热反应时间应控制在8h以内。XRD结果显示，NaYF4纳米粒为立方相结晶。荧光测定结果显示，两种纳米粒均具有较高的光转换效率，在低功率激光激发下即可产生较强的大于650 nm的荧光，可用于体内成像。MTT结果表明，NaYF4纳米粒无明显细胞毒性。 在上述合成的基础上，利用St(o)ber水解法制备了具有Fe3O4、NaYF4内核及TiO2壳的多功能纳米复合物(DCSNCs): NaYF4-Fe3O4@TiO2。通过物理吸附将HA修饰于DCSNCs表面(HA-DCSNCs)，以增加载体的靶向性和稳定性。HA-DCSNCs对阿霉素的负载及释放均表现出明显的pH敏感性，这种pH敏感释放将有利于纳米粒在肿瘤部位发挥细胞毒性作用。 第三，对HA-DCSNCs-DOX及其介导的SDT抗肿瘤效果进行了体外评价。结果显示HA-DCSNCs介导的SDT具有明显的细胞毒性，而空白HA-DCSNCs对细胞存活率无影响，载药HA-DCSNCs-DOX经超声后表现出更强的细胞毒性，说明两者联合应用可产生协同抗肿瘤作用。进一步研究显示，HA-DCSNCs介导的SDT可促进细胞的早期凋亡，SDT与DOX联合应用可提高晚期凋亡和坏死细胞的比例。HA-DCSNCs介导的SDT抗肿瘤作用机制研究发现，HA-DCSNCs在超声作用下可生成大量ROS，其抗肿瘤作用主要由ROS产生。 最后，以S180肉瘤为研究对象，考察了HA-DCSNCs-DOX及其介导SDT体内抗肿瘤效果。尾静脉注射后，HA-DCSNCs-DOX表现出显著的肿瘤靶向能力，并能长时间滞留于肿瘤内部。体内治疗效果显示，HA-DCSNCs-DOX与超声联用可显著抑制肿瘤生长，肿瘤体积逐渐缩小，最终几乎消失，免疫组化结果显示肿瘤组织已坏死。相比之下，其他治疗组肿瘤仍缓慢生长，肿瘤组织部分坏死。此外，HA-DCSNCs-DOX表现出良好的上转换成像性能，可用于体内成像。以上结果表明，HA-DCSNCs可用于生物成像及靶向药物传递，同时说明SDT与化疗联合应用具有良好的应用前景。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

第一章 绪论

1．1 多功能诊断治疗系统

1．2 四氧化三铁在肿瘤诊断治疗中的应用

1．3 上转换纳米粒在肿瘤诊断治疗中的应用

1．4 二氧化钛在肿瘤治疗中的应用

1．5 课题的提出

第二章 磁性Fe3O4的制备、表征及体内外光热效果评价

2．1 材料与仪器

2．1．1 材料

2．1．2 仪器

2．1．3 细胞及动物

2．2 实验方法

2．2．1 磁性Fe3O4的制备

2．2．2 Fe3O4@CMCTS的制备

2．2．3 ICG-Fe3O4@CMCTS的制备

2．2．4 FL标记的Fe3O4和Fe3O4@CMCTS的制备

2．2．5 金纳米囊(HAuNS)的合成

2．2．6 纳米粒的表征

2．2．7 Fe3O4@CMCTS的体外稳定性考察

2．2．8 BSA蛋白吸附实验

2．2．9 体外升温效果考察

2．2．10 空白载体的细胞毒性考察

2．2．11 Fe3O4@CMCTS的细胞摄取实验

2．2．12 体外光热效果研究

2．2．13 Fe3O4@CMCTS的体内过程研究

2．2．14 Fe3O4@CMCTS的体内光热治疗

2．3 结果与讨论

2．3．1 Fe3O4、Fe3O4@CMCTS的制备

2．3．2 Fe3O4、Fe3O4@CMCTS的表征

2．3．3 Zeta电位

2．3．4 Fe3O4与Fe3O4@CMCTS在生理条件下的稳定性考察

2．3．5 蛋白吸附实验

2．3．6 横向弛豫率(r2)的测定

2．3．7 体外光热效果测定

2．3．8 Fe3O4@CMCTS细胞毒性研究

2．3．9 Fe3O4@CMCTS的细胞摄取

2．3．10 Fe3O4@CMCTS体外光热抗肿瘤效果研究

2．3．11 Fe3O4@CMCTS的体内过程研究

2．3．12 Fe3O4@CMCTS的光热治疗研究

2．3．13 Fe3O4@CMCTS对正常组织的毒性考察

2．4 本章小结

第三章 NaYF4纳米粒的制备及性质研究

3．1 材料与仪器

3．1．1 材料

3．1．2 仪器

3．2 实验方法

3．2．1 NaYF4纳米粒的制备

3．2．2 NaYF4纳米粒的表征

3．2．3 细胞毒性实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 NaYF4上转换纳米粒的形态及粒径

3．3．2 NaYF4上转换纳米粒的晶型鉴定

3．3．3 NaYF4上转换纳米粒的荧光光谱测定

3．3．4 NaYF4上转换纳米粒的细胞毒性检测

3．4 本章小结

第四章 多功能HA-DCSNCs的制备及表征

4．1 材料与仪器

4．1．1 材料

4．1．2 仪器

4．2 实验方法

4．2．1 DCSNCs的制备

4．2．2 透明质酸(HA)修饰的DCSNCs(HA-DCSNCs)的制备

4．2．3 DCSNCs及HA-DCSNCs的表征

4．2．4 HA-DCSNCs对阿霉素的负载

4．2．5 DOX的体外释放研究

4．3 结果与讨论

4．3．1 DCSNCs与HA-DCSNCs的制备

4．3．2 DCSNCs与HA-DCSNCs的表征

4．3．3 DOX的负载

4．3．4 DOX的释放

4．4 本章小结

第五章 HA-DCSNCs体外声动力治疗效果研究

5．1 材料与仪器

5．1．1 材料

5．1．2 仪器

5．1．3 细胞

5．2 实验方法

5．2．1 HA-DCSNCs的细胞毒性考察

5．2．2 HA-DCSNCs-DOX的细胞摄取

5．2．3 SDT及其与DOX联合应用的细胞毒性研究

5．2．4 SDT及其与DOX联合治疗诱导细胞凋亡研究

5．2．5 ROS的测定

5．3 结果与讨论

5．3．1 HA-DCSNCs的细胞毒性

5．3．2 HA-DCSNCs-DOX的细胞摄取

5．3．3 SDT及其与DOX联合应用的细胞毒性研究

5．3．4 SDT及其与DOX联合治疗诱导细胞凋亡研究

5．3．5 ROS的测定

5．4 本章小结

第六章 HA-DCSNCs介导的SDT与DOX体内联合抗肿瘤研究

6．1 材料与仪器

6．1．1 材料

6．1．2 仪器

6．1．3 细胞及动物

6．2 实验方法

6．2．1 小鼠S180肉瘤模型的建立

6．2．2 HA-DCSNCs的体内上转换成像研究

6．2．3 HA-DCSNCs-DOX的体内分布研究

6．2．4 给药方案及药效学评价

6．2．5 组织病理学检查

6．3 结果与讨论

6．3．1 HA-DCSNCs的体内上转换成像研究

6．3．2 HA-DCSNCs-DOX的体内分布研究

6．3．3 SDT及其与DOX联合抗肿瘤研究

6．3．4 免疫组化观察

6．4 本章小结

全文总结

参考文献

综述 新型肿瘤治疗方法的研究进展

作者简历及在读期间所取得的科研成果