葡萄种子辐射诱变效应及其单株早期筛选鉴定研究

摘要

葡萄为葡萄科(Vitaceae)葡萄属（Vitis）植物，是世界主要水果之一。我国以鲜食葡萄生产为主，浙江省是我国南方鲜食葡萄的主产地之一，但栽培品种多从国外引进，适合南方地区设施栽培的葡萄品种不多。本论文以‘醉金香’葡萄种子为材料，通过137Cs-γ射线辐射处理，对不同辐射剂量处理后葡萄种子发芽、幼苗生长、幼株的叶绿素荧光参数等生物学诱变效应进行了研究，并利用SSR分子标记对早期筛选出的诱变单株进行了分子鉴定和遗传多样性分析，旨在为葡萄辐射育种和产业发展提供理论指导。主要研究结果如下:
　　(1)137Cs-γ射线对葡萄种子的辐射效应明显，表现为辐射使种子发芽率、发芽势和发芽指数下降，平均发芽天数增加，出苗率、成苗率下降，幼苗株高变矮，茎杆变细、木质化时间延迟，黄化、白化苗增多等，并出现了不同类型的变异性状，且随辐照剂量的增加影响加大。137Cs-γ射线对葡萄叶绿素荧光参数的影响较小，对各荧光参数的影响不同，且与辐照剂量不呈线性关系，高剂量(50Gy)的处理各荧光参数与对照差异显著，影响较大。综合种子发芽、幼苗生长及叶绿素荧光参数分析结果，30Gy的辐射最有利于变异的产生与选择。因此认为20～40Gy为葡萄γ射线诱变育种较为合适的剂量范围。
　　(2)利用正交设计对影响PCR反应的Mg2+、dNTP、Taq聚合酶、引物和模板DNA这5个主要因素进行了优化筛选，建立了葡萄SSR-PCR的20μL反应体系为:10×PCR Buffer2μL，Mg2+1.5 mmol/L，dNTP0.2 mmol/L，Taq酶1.0 U，引物0.4μmol/L，模板DNA50 ng，ddH2O补足。
　　(3)从122对SSR引物中筛选出了48对带型清晰、重复性高、多态性好的引物，确定了每对引物的最佳退火温度，主要在50～60℃之间。用这些引物对63个葡萄早期筛选单株及母本进行SSR-PCR扩增，共扩增出275条带，其中多态性条带254条，多态性百分率为92.4％。每对引物可扩增3～10个等位基因，平均为5.7个。扩增片段长度在100～500 bp之间，以150～350 bp居多。引物扩增的多态位点数比较丰富，有31对引物的多态性百分率达到了100％。
　　(4)对64个葡萄样品的SSR结果进行遗传相似系数和聚类分析。结果显示，各样品的遗传相似系数在0.644～0.891之间，CK-6和30-6的最小，30-7和50-1的最大。利用SSR分子标记能将供试验的64份葡萄样品相互区分。在遗传相似性系数0.77处将所有样品分为8个类群，其中CK-6、30-6、CK-4、20-1、CK-9、20-3这6个单株分别单独聚为一类;CK-10、CK-8、CK-5及CK-3聚为一类;其余53个单株与‘醉金香’母本聚为一个大类。各单株与‘醉金香’母本均有一定的遗传差异，CK-4、CK-6和CK-9等未经辐射的实生单株与‘醉金香’母本具有较大的遗传差异，表明葡萄的自然变异较高，有利于实生选种;20-1、20-3和30-6等辐射处理单株与‘醉金香’母本和对照均具有较大遗传差异，有望成为新的变异品种，但有待于进一步研究确认。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 国内外葡萄育种研究现状

1．1．1 杂交育种

1．1．2 实生选种

1．1．3 无性系选种

1．1．4 诱变育种

1．1．5 生物技术育种

1．1．6 无核葡萄育种概况

1．2 辐射诱变育种的研究

1．2．1 辐射诱变育种研究概述

1．2．2 辐射诱变效应研究

1．2．3 辐射诱变后代筛选和鉴定

1．3 分子标记技术的研究

1．3．1 分子标记类型

1．3．2 常用分子标记

1．3．3 SSR在葡萄上的应用

1．4 本研究的目的与意义

第二章 辐射诱变对葡萄种子发芽及苗期生长的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 材料及来源

2．1．2 种子采集与贮藏

2．1．3 种子辐射处理

2．1．4 种子催芽与播种

2．1．5 播种后管理与定植

2．1．6 数据统计与处理

2．2 结果与分析

2．2．1 辐射处理对葡萄种子发芽的影响

2．2．2 辐射处理对葡萄幼苗早期生长及形态的影响

2．3 讨论

第三章 辐射诱变对葡萄幼株叶绿素荧光特性的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料与设计

3．1．2 相对叶绿素含量的测定

3．1．3 叶绿素荧光参数的测定

3．1．4 荧光参数的定义与计算公式

3．1．5 数据处理与统计分析

3．2 结果与分析

3．2．1 辐照处理对相对叶绿素含量的影响

3．2．2 辐照处理对叶绿素荧光的影响

3．3 讨论

第四章 葡萄诱变单株的早期筛选和分子鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 主要试剂及仪器设备

4．1．3 葡萄基因组DNA的提取

4．1．4 DNA样品检测

4．1．5 葡萄SSR-PCR扩增

4．1．6 扩增产物的检测

4．2 结果与分析

4．2．1 DNA提取质量检测

4．2．2 SSR最佳反应体系优化与建立

4．2．3 引物及退火温度筛选结果

4．2．4 诱变单株SSR标记的遗传多样性分析

4．3 讨论

4．3．1 葡萄基因组DNA的提取

4．3．2 SSR-PCR反应的影响因素

4．3．3 葡萄诱变单株遗传多样性分析

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录