水稻OsMsh6基因的多样性及其插入突变体的离子束诱变效应

摘要

错配修复是DNA损伤修复的一个重要途径，主要司职DNA合成、遗传重组及损伤过程中新发生的单个及少数碱基的缺失、插入及错配，对维持基因组稳定性和DNA复制保真度至关重要。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是模式单子叶植物，通过生物信息学的手段在其基因组中已鉴定出涉及到各种DNA损伤修复途径的基因，Os09g24220（OsMsh6）就是其中与拟南芥Msh6(At4G02070)同源的一个错配修复基因。但迄今对该基因的功能、多样性及其突变体对诱变处理的反应尚缺乏了解。为此，本文分析了错配修复基因OsMsh6的多样性，并研究了该基因插入突变体的离子束诱变效应。主要结果如下:
　　1.OsMsh6基因的多样性。将日本晴基因组DNA分别与其它192个水稻品种等量混合建池，对OsMsh6基因的2334-3433bp区域进行PCR扩增，形成的异质双链复合物经CELⅠ处理后，在192份异质双链复合物中共检测到24份存在碱基错配，说明有12.5％的品种与日本晴间具有SNP。测序结果表明扩增区段内共有8个SNP，其中2个位于内含子，6个位于外显子。根据SNP的类型，可将这24个品种分为4类，第一类包含2个品种，有6个SNP，分别位于2867、2953、3051、3074、3093和3210bp处;第二类和第三类均都含9个品种和存在1个SNP，分别位于3055和3093bp处;第四类包括4个品种，存在2个SNP，分别位于3093和3370bp处。这些研究结果对进一步从分子水平上揭示不同品种的辐射敏感性和突变频率的差异将具有重要意义。
　　2.OsMsh6插入突变体的分子与表型鉴定。利用3引物PCR和RT-PCR对该基因的3个插入突变体NF9010、NF7784和ND6011进行分子鉴定。3引物PCR结果证实了Tos17的插入，而且它们都是纯合的插入突变体。RT-PCR分析显示，在突变体NF9010和NF7784的幼苗中，利用扩增片段位于插入位点前的引物，可检测到OsMsh6 mRNA转录片段，而利用跨越插入位点或位于插入位点之后的引物则检测不到转录产物，说明尽管这两个突变体中具有截短的转录产物，但缺乏全长和有功能的OsMsh6 mRNA;而在突变体ND6011中，利用所有位于功能区上游、中部和下游的引物均能检测到OsMsh6转录产物，利用跨越插入位点的引物则检测不到转录产物，表明ND6011具有功能性OsMsh6 mRNA，但不是全长mRNA。对3个插入突变体的株高、有效分蘖数、穗长、结实率和千粒质量等农艺性状进行考察，并与其野生型进行了比较。结果显示，每个突变体至少有一个性状发生显著改变。突变体ND6011只是结实率显著（P＜0.05）降低，而NF7784和NF9010的穗长和结实率均极显著（P＜0.01）下降，且NF9010的株高也显著降低。因此，OsMsh6基因的Tos17插入突变体具有突变子表型，部分农艺性状发生了显著改变，而且不同突变体具有不同的突变表型，与Tos17插入不同位置对OsMsh6基因功能的影响有关。这些研究结果为进一步研究该基因在水稻DNA修复中的功能和探讨这类突变体在水稻诱变育种中的应用奠定了基础。
　　3.OsMsh6插入突变体的离子束诱变效应。对突变体的种子采用脉冲式注入，注入剂量分别为1000、3000和5000次，每次流量为2.6×1015 N+/cm。M1代多数苗期生理指标和田间植株结实率测定的结果表明，插入突变体对离子束辐照的敏感性增强，特别是在高剂量下。利用插入位点前的引物进行的RT-PCR分析结果显示，在不同处理剂量下，突变体NF9010和NF7784的OsMsh6表达水平没有明显差异，而对照日本晴和具有全长mRNA转录产物的ND6011则有随处理剂量增高而表达水平逐渐增高的趋势。因此推测OsMsh6基因参与了DNA损伤的修复。当其功能丧失后，影响了修复能力，导致辐照敏感性增强。在日本晴和突变体的M2代均出现了多种表型突变，如叶色、叶宽、分蘖数、株高、成熟期、育性等，并利用SSR进行了真实性鉴定。不同剂量下，日本晴、ND6011、NF7784和NF9010的M2表型突变频率分别为0.54％-1.01％、3.52％-4.67％、3.39％-7.58％和2.81％-14.2％，而且3个突变体的M2表型突变频率均有随剂量增大突变频率升高的趋势;相同剂量下，3个突变体材料的突变频率明显高日本晴，平均提高4-7倍。利用CELⅠ对错配的识别特性与测序技术相结合，分析了日本晴和突变体NF9010在3000次脉冲处理剂量下30个M2株系的分子水平上的突变。在分析的24个扩增片段中检测到两个片段存在点突变，其中日本晴中检测到50个点突变，突变体NF9010株系中检测到56个点突变。从突变的特性来看，没有检测到插入和缺失突变，只有单碱基置换，碱基转换突变的频率明显高于颠换，而且嘌呤突变明显高于嘧啶。突变体NF9010的点突变频率均高于日本晴。这些结果对揭示离子束诱发突变的特点和利用MMR突变体构建高效的诱变育种体系具有重要意义。

目录

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论文说明

致谢

主要缩略语

摘要

第一章 文献综述

1．1 MMR系统

1．1．1 原核生物MMR系统

1．1．2 高等植物MMR系统

1．2 MMR系统作用机制及功能

1．2．1 MMR系统作用机制

1．2．2 MMR系统功能

1．3 损伤修复相关基因的遗传多样性

1．3．1 基因多样性-SNP的研究手段

1．3．2 MMR基因的遗传多样性

1．4 MMR缺陷的产生途经与效应

1．4．1 理化诱变

1．4．2 DNA插入诱变

1．4．3 显性负抑制作用

1．4．4 MMR基因的RNA干涉

1．5 离子束辐照对DNA的损伤与诱变效应

1．6 本研究的目的与主要内容

1．6．1 错配修复基因OsMsh6的多样性分析

1．6．2 OsMsh6基因插入突变体的分子鉴定与农艺性状分析

1．6．3 OsMsh6基因插入突变体的离子束诱变效应

第二章 错配修复基因OsMsh6的遗传多样性分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 芹菜CELⅠ酶的提取

2．1．3 DNA提取

2．1．4 DNA混池

2．1．5 OsMsh6的序列分析与引物设计

2．1．6 PCR扩增与异源双链DNA的形成

2．1．7 CELⅠ酶处理

2．1．8 电泳检测

2．1．9 扩增片段的纯化与测序

2．2 结果与分析

2．2．1 OsMsh6的序列分析

2．2．2 异质DNA双链的CELⅠ切割

2．2．3 测序分析

2．3 讨论

第三章 OsMsh6基因插入突变体的分子鉴定与农艺性状分析

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 插入突变体的PCR鉴定

3．1．3 插入突变体的RT-PCR分析

3．1．4 纯合插入突变体的农艺特性考察

3．1．5 花粉生活力检测

3．2 结果与分析

3．2．1 插入突变系的PCR鉴定

3．2．2 OsMsh6基因的RT-PCR分析

3．2．3 插入突变体的农艺性状变化

3．2．4 花粉育性检测

3．3 讨论

第四章 OsMsh6基因插入突变体的离子束诱变效应

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 氮离子注入处理

4．1．3 M1代苗期生理指标观察测量

4．1．4 M1代不同剂量处理下表达分析

4．1．5 M1代成熟期农艺性状考察

4．1．6 M2突变群体的构建与表型观察

4．1．7 M2代DNA分子水平上的变异

4．2 结果与分析

4．2．1 离子注入对OsMsh6基因表达的影响

4．2．2 M1代损伤效应

4．2．3 M2代诱变效应

4．3 讨论

参考文献

作者简历