卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术对小鼠肾脏疾病相关印记基因表达及甲基化状态的影响

摘要

自1978年人类首例体外受精（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF）婴儿出生以来，以IVF和卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)为主流技术的辅助生殖技术（assisted reproductive techonologies，ART）已经成为越来越多不孕家庭选择的不孕症治疗技术。ART子代的健康状况，尤其是ICSI子代的健康已经成为ART技术安全性的研究热点之一。
　　ICSI技术主要针对男性少、弱、畸精子症患者，这些患者因精子数量过少或形态功能障碍，不能穿透卵母细胞透明带，无法完成精卵融合，因而无法完成受精过程或导致受精率显著下降。ICSI技术不仅包括配子和胚胎的体外培养的过程，且其受精过程是通过显徼注射系统人为选择精子，并直接将其注入卵细胞胞浆内。人为选择精子意味着避开了卵子对精子的自然选择机制，同时，注射过程可对卵子形成轻微的机械性损伤，并带入一些异源性物质，如聚乙烯吡咯酮等，这些操作可能对配子的受精和后续胚胎的分化和发育产生影响。
　　从ICSI技术开展以来，陆续有大规模流行病学研究报导ICSI子代存在出生缺陷的风险较正常儿童高，但子代出现生长发育异常的机制目前尚未明确。研究发现哺乳动物的发育先后经历两次全基因组DNA甲基化重新编程:第一次在原始生殖细胞发育期全基因组范围内去甲基化，而后在配子成熟过程中重新获得甲基化;第二次发生在胚胎植入前基因组DNA再次发生去甲基化，印记基因则逃避了去甲基化过程，其甲基化水平维持不变。ICSI技术不仅涉及配子短期体外培养过程，而且在卵子MⅡ期干扰了其正常受精过程并涉及植入前胚胎发育过程，因此可能对印记基因甲基化状态的获得和维持产生影响。对ICSI子代研究发现差异甲基化区(differentially methylated region，DMR)的甲基化修饰改变可能是导致其出生缺陷的原因之一。
　　已有的回顾性流行病学调查表明ICSI子代存在泌尿道畸形发生率升高的趋势，同时，已知一些印记基因，如MEST、H19、IGF2、PEG3、SNRPN、CDKNLC、SOCS-3、SFRP1、RASAL1等，与肾脏发育缺陷、肾脏纤维化及肾脏肿瘤性疾病的发生关系密切。ICSI技术是否可通过干扰肾脏基因印记而影响ICSI子代肾脏疾病的发生是有待解答的ART安全性问题之一。
　　本研究建立ICSI小鼠模型（实验组）和2细胞胚胎移植小鼠模型（对照组），比较分析ICSI出生小鼠与对照小鼠子代父源印记基因H19以及母源印记基因Igf2、Snrpn、Mest和Peg3的表达差异，检测了相关印记基因DMR的甲基化状态，分析了ICSI技术对子代肾脏疾病相关印记基因表达的影响，探究了相关印记基因表达异常可能存在的表观遗传学机制，为ICSI技术的安全性评估理论依据。
　　第一部分 ICSI技术对小鼠肾脏疾病相关印记基因H19、Igf2、Mest、Peg3和Snrpn的表达的影响
　　目的:建立ICSI小鼠模型（实验组）和2细胞胚胎移植小鼠模型（对照组），研究ICSI子代小鼠肾脏中肾脏疾病相关印记基因H19、Igf2、Mest、Peg3和Snrpn的表达与2细胞胚胎移植组子代是否存在差异，阐明ICSI技术对目的印记基因表达的影响。
　　方法:利用C57BL/6J小鼠，建立ICSI小鼠模型和2细胞胚胎移植小鼠模型，出生小鼠饲养至成年期（10周）和老年期（1.5年），收集两组小鼠的肾脏组织，两个时期各自收集ICSI小鼠肾脏8例和2细胞胚胎移植小鼠肾脏10例，比较两组小鼠及其肾脏的重量，并采用逆转录实时荧光定量PCR检测肾脏中目的基因mRNA的表达水平。
　　结果:在成年子代中，ICSI小鼠肾脏中H19、Mest、Peg3和Snrpn的表达水平较对照组均显著上调。而Igf2的表达水平无显著差异。而在老年子代中，ICSI组Snrpn较对照组呈显著下调，而其余4个基因与对照组相比无显著差异。
　　结论:ICSI子代肾脏中存在印记基因H19、Mest、Peg3和Snrpn的表达异常，可能影响ICSI子代肾脏疾病的发生。
　　第二部分 ICSI技术对小鼠肾脏中H19DMR、MestDMR、Peg3DMR和SnrpnDMR的甲基化水平的影响
　　目的:研究ICSI子代肾脏中H19DMR、MestDMR、Peg3DMR和SnrpnDMR的甲基化状态，比较其与对照组之间的差异，并探索其与基因表达间的关系。
　　方法:选择成年期和老年期收集的小鼠肾脏组织，两个时期各自收集ICSI小鼠肾脏8例和2细胞胚胎移植小鼠肾脏10例，采用亚硫酸盐处理后克隆测序(bisulfitesequencing，BSP)法检测ICSI组与对照组H19DMR和SnrpnDMR的DNA甲基化状态，并采用焦磷酸盐测序法对其中部分CpG位点进行验证，同时采用焦磷酸盐测序法对MestDMR和Peg3DMR区DNA甲基化状态进行检测。
　　结果:成年ICSI子代肾脏H19DMR、MestDMR、Peg3DMR甲基化水平较对照组均显著降低，与其调控的基因的表达量较对照组升高均相符;成年ICSI子代肾脏SnrpnDMR甲基化水平与对照组呈现降低趋势，但未达到统计学显著性差异;老年ICSI子代肾脏SnrpnDMR甲基化水平呈显著升高，与Snrpn基因的相对表达量降低相符。
　　结论:成年ICSI子代肾脏中H19、 Mest、Peg3基因mRNA表达水平上调可能与基因DMR的甲基化水平改变有关，老年ICSI子代肾脏中Snrpn基因的相对表达量降低也可能与其DMR高甲基化水平相关。ICSI技术可能干扰了早期配子受精及胚胎植入前的甲基化状态。随着年龄增长，ICSI小鼠SnrpnDMR甲基化水平可能重新编程。