啤用大麦籽粒混浊敏感蛋白的遗传机理与氮肥反应研究

摘要

大麦作为酿造啤酒的主要原料，其品质优劣直接影响啤酒的商品质量及价值。啤酒是一种成分复杂、稳定性不强的胶体溶液，在贮存和运输过程中易发生混浊沉淀。混浊是一个严重的品质问题，它显著缩短啤酒的贮藏与货架时间。啤酒中含有大量大麦在发芽和酿造过程中被水解、化学修饰的蛋白，正是这些蛋白组分造成啤酒混浊。减少啤酒生产原料啤用大麦籽粒的混浊蛋白含量，是改良啤用大麦品质的重要内容。本文主要研究大麦籽粒混浊敏感蛋白的基因型差异、遗传机理及不同氮肥运筹对混浊性状的影响，主要结果如下: 1.栽培大麦与西藏野生大麦BTI-CMe多态性及分子标记开发 利用SE抗体对本实验室收集的243份大麦材料（其中栽培大麦71份，西藏野生大麦172份）的籽粒蛋白进行SDS-PAGE和免疫印迹检测，发现一些材料在13kDa附近有蛋白条带（即BTI-CMe），记为SE+ve;而在另一些材料无该蛋白条带，记为SE-ve。在供试的西藏野生大麦中，103份为SE+ve类型，69份为SE-ve类型;而在栽培大麦中，38份为SE+ve类型，33份为SE-ve类型。进而分析了BTI-CMe基因在37份大麦材料中的多态性，发现该基因的蛋白编码区存在22个SNP，可分为6种单倍型，且SE+ve和SE-ve之间的区别在于SNP234，SNP313和SNP385。利用SNP313的A/T差异，设计了等位特异性分子标记用于筛选SE蛋白类型，结果显示分子标记的筛选结果与蛋白免疫印迹的结果高度一致。同时，以Franklin(SE+ve)/Yerong(SE-ve)杂交组合构建的DH群体为材料，利用该标记将BTI-CMe蛋白控制基因定位在3H染色体上的bPb-0527与bPb-1814之间。 2.BTI-CMe混浊能力的差异及机制 BTI-CMe蛋白的氨基酸组成分析表明，SE+ve和SE-ve类型之间存在差异，主要为C端氨基酸的组成。将Franklin(SE+ve)和Yerong(SE-ve)的BTI-CMe进行原核表达并纯化，经分析发现这两类重组蛋白均具有抑制胰蛋白酶的活性。将纯化后的蛋白质分别添加至市售啤酒中，发现添加BTI-CMe后啤酒的混浊度与酒精冷混浊值均显著升高，且SE+ve类型较SE-ve类型致浊能力更强。以原始浊度和酒精冷混浊值为响应值，分析了各个因素（两类BTI-CMe蛋白和单宁）的显著性以及因素间的互作，发现无论是原始浊度还是酒精冷混浊值，均与两类BTI-CMe蛋白和单宁浓度呈显著正相关，且SE+ve类型蛋白引起的两种混浊值均要显著高于SE-ve，BTI-CMe与单宁之间存在显著互作。 3.啤酒混浊性状的QTL分析 以高密度标记的Franklin/Yerong DH群体为供试材料，分析了与啤酒混浊性状相关的QTL位点，共检测到6个QTLs，它们都为首次报导与混浊性状有关的QTLs。酒精冷混浊性状，检测到1个QTL，位于大麦第4H染色体长臂108cM附近，可解释20％左右的群体变异，命名为qACHD。对3个与单宁量相关的混浊敏感蛋白含量进行QTL分析，共检测到5个QTLs，分别位于1H、5H和6H染色体上，其中在1H约50cM附近区域有多个QTLs重叠。 4.啤酒中混浊敏感蛋白的蛋白质组学分析鉴定 收集啤酒中的酒精冷混浊沉淀以及与单宁相关的混浊敏感蛋白沉淀进行蛋白质组学分析，以期明确混浊敏感蛋白的组成。经SDS-PAGE分析，发现酒精冷混浊蛋白沉淀与澄清啤酒上清液在15kDa附近有差异明显的条带，将该蛋白条带进行LC-MS分析，发现啤酒冷混浊中的混浊敏感蛋白包含有胰蛋白酶抑制剂BTI-CMe、α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CMd和α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CMb。同时，通过双向凝胶电泳联合质谱分析啤酒中混浊敏感蛋白，发现包含有α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CMb和一系列广泛参与细胞代谢的组成型表达的酵母源蛋白质。这些蛋白质均含有疏水基团，且浓度较高，故参与啤酒的混浊沉淀形成。 5.混浊敏感蛋白BATI-CMb和BATI-CMd的遗传分析及分子标记开发 分析混浊敏感蛋白BTI-CMb和BTI-CMd的遗传位置，发现与酒精冷混浊QTL一致，故认为这两个基因是qACHD的候选基因，控制冷混浊性状。随后，分析了Yerong（低混浊）和Franklin（高混浊）中这两个候选基因及其编码的蛋白质，与Yerong相比，Franklin在BATI-CMb基因的CDS区有9个SNP;在BATI-CMd基因的CDS区有一处6个碱基的缺失和1个SNP。推测CDS区的碱基不同会引起一些氨基酸差异从而最终影响混浊能力，另在非编码区同样存在SNP与碱基插入缺失现象，这可能会引起这两个基因在表达水平上的差异。基于以上分析结果，分别针对BTI-CMb和BTI-CMd开发出有效的基因特异分子标记，并将分子标记整合进原遗传图谱中重新进行酒精冷混浊性状的QTL分析，发现qACHD仍在该区域。 6.啤酒混浊性状与麦芽中蛋白质、氨基酸组成的相关性分析 选取23份混浊性状差异较大的麦芽材料测定α-淀粉酶活性、总蛋白含量、不同蛋白组分含量、氨基酸含量和混浊性状，分析各指标与混浊性状之间的相关性。混浊敏感蛋白BATI-CMb、BATI-CMd是α-淀粉酶抑制剂，但相关性分析显示虽然α-淀粉酶活性与混浊性状呈负相关，但不显著。蛋白质总量、球蛋白和醇溶蛋白与各混浊性状之间存在极显著的正相关。另外，谷氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸均与各混浊性状呈显著正相关;半胱氨酸与酒精冷混浊值存在显著正相关，但与其他混浊性状无显著相关。 7.氮肥运筹对啤酒混浊性状的影响 选用四个混浊性状差异的大麦品种，在不同的氮肥用量及运筹条件下，探讨氮肥对混浊性状的影响。发现不同品种和氮肥运筹处理中，混浊性状均存在极显著差异。不同氮肥用量下，混浊敏感蛋白HAP1和HAP3差异极显著，但酒精冷混浊值和HAP2无显著差异。各因素之间的互作对部分混浊性状亦有着显著影响。因此，生产上应考虑种植低混浊品种，大田氮肥运筹上应减少抽穗肥。

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缩略词表

图目录

表目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 啤酒混浊概述

1．2 混浊蛋白-混浊多酚聚合体的形成机理

1．3 混浊敏感蛋白的研究进展

1．4 混浊性状的分析方法

1．5 延缓啤酒混浊形成的方法

1．5．1 冷藏后熟

1．5．2 超滤

1．5．3 添加吸附剂

1．5．4 酶学法

1．6 立题意义及技术路线

1．6．1 立题意义

1．6．2 技术路线

第二章 栽培与西藏野生大麦BTI-CMe多态性及分子标记开发

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 试验材料

2．2．2 SE蛋白多态性筛选

2．2．3 BTI-CMe基因的克隆与测序

2．2．4 等位基因特异性PCR筛选

2．2．5 SE蛋白的定位分析

2．2．6 数据处理

2．3 结果与分析

2．3．1 SE蛋白在栽培大麦和西藏野生大麦中的多态性

2．3．2 BTI-CMe的基因多态性

2．3．3 等位特异性PCR筛选SE蛋白多态性

2．3．4 SE蛋白的遗传定位

2．4 讨论

第三章 BTI-CMe混浊差异及其机制研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料

3．2．2 原核表达与纯化

3．2．3 酶抑制活性与混浊能力的检测

3．2．4 响应面分析

3．2．5 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 BTI-CMe蛋白的氨基酸序列分析

3．3．2 BTI-CMe蛋白的原核表达、纯化及酶活性

3．3．3 BTI-CMe蛋白的混浊能力分析

3．3．4 BTI-CMe蛋白与单宁的互作

3．4 讨论

第四章 啤酒混浊性状的QTL分析

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 试验材料

4．2．2 微型制麦试验

4．2．3 微型酿酒试验

4．2．4 啤酒混浊性状测定

4．2．5 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 混浊性状的表型差异及相关性分析

4．3．2 混浊性状的相关性分析

4．3．3 混浊相关性状的QTL定位

4．4 讨论

第五章 啤酒中混浊敏感蛋白的鉴定分析

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 试验材料

5．2．2 SDS-PAGE／LC-MS

5．2．3 2-DE／MS

5．3 结果与分析

5．3．1 SDS-PAGE图分析混浊敏感蛋白

5．3．2 LC-MS鉴定的混浊蛋白

5．3．3 2-D电泳图分析

5．3．4 质谱鉴定的混浊蛋白

5．4 讨论

第六章 混浊敏感蛋白BATI-CMb和BATI-CMd的遗传分析及分子标记开发

6．1 前言

6．2 材料与方法

6．2．1 试验材料

6．2．2 基因克隆及测序分析

6．2．3 分子标记开发

6．2．4 遗传定位

6．2．5 数据处理

6．3 结果与分析

6．3．1 候选基因筛选

6．3．2 BATI-CMb核苷酸与氨基酸组成差异分析

6．3．3 BATI-CMd核苷酸与氨基酸组成差异分析

6．3．4 分子标记开发

6．3．5 遗传定位分析

6．4 讨论

第七章 啤酒混浊性状与麦芽蛋白质、氨基酸组成的相关分析

7．1 前言

7．2 材料与方法

7．2．1 试验材料

7．2．2 总蛋白质含量测定

7．2．3 不同类蛋白质的分离与测定

7．2．4 可溶性氨基酸含量的测定

7．2．5 α-淀粉酶活性测定

7．2．6 混浊性状测定

7．2．7 数据统计分析

7．3 结果与分析

7．3．1 各性状的基因型变异

7．3．2 各性状的相关性分析

7．4 讨论

第八章 氮肥运筹对啤酒混浊性状的影响

8．1 前言

8．2 材料与方法

8．2．1 试验材料及种植

8．2．2 实验室微型制麦

8．2．3 实验室微型酿酒试验

8．2．4 混浊性状的测定

8．2．5 数据分析

8．3 结果与分析

8．3．1 各因素对混浊性状的影响

8．3．2 不同品种间混浊性状的差异

8．3．3 不同氮肥运筹对混浊性状的影响

8．3．4 不同氮肥施用量对混浊性状的影响

8．3．5 氮肥施用与运筹互作对混浊性状的影响

8．4 讨论

第九章 全文总结与展望

参考文献

作者简历