基于网络药理学的芪参益气方抗心肌缺血整合作用研究

摘要

中药复方药效物质及其作用机制的研究是中药现代化的关键科学问题之一。秉承中医整体论的治病理念，中药复方与复杂性疾病之间的相互作用是“系统-系统”的非线性、复杂作用模式，因而采用传统方法难以满足揭示这种复杂网络状关联关系。近年兴起的网络药理学和系统生物学试图从宏观或整体调控的角度诠释药物对生物网络的作用，为中药复方作用机制研究提供了新的研究思路和技术手段。在临床上芪参益气方用于治疗缺血性心脏病，其有效性已得到循证医学的研究证实，但芪参益气方抗心肌缺血的整合作用还缺乏系统性研究，阻碍了芪参益气方被国际市场认可和接受的进程。鉴于此，本论文运用网络药理学方法和技术，开展芪参益气方抗心肌缺血作用研究，通过整合分子、细胞及动物水平的多层次研究，初步诠释其多成分组合、多靶点、多途径的整合协同作用模式。
　　主要研究内容如下:
　　1、构建了冠心病网络药理学研究平台CHD@ZJU V2.0，并开展相关网络分析。通过整合文献、疾病相关公开数据库及蛋白-蛋白相互作用关系等资源，构建冠心病疾病网络，并采用网络拓扑学、子簇聚类及生物功能GO等开展网络分析，结果显示与疾病发病机制相关的生物学途径主要有:免疫炎症反应、血管生成、缺氧和氧化应激反应、能量代谢等;
　　2、研究了芪参益气方主要代表性成分对疾病网络的调控作用。采用文本知识挖掘技术得到芪参益气方主要成分的作用靶点信息，构建药物-疾病网络，研究通过网络分析发现人参皂苷Rg1(Rg1)和丹参素(DSS)的共同作用靶点是JUN、MAPK8和MAPK3，黄芪甲苷(Ast)的心血管药理作用与免疫炎症反应、细胞迁移、粘附及血液循环等相关;
　　3、研究了主要活性成分Ast、DSS、Rg1和反式橙花叔醇(ENL)单给及其组合给药抗大鼠急性心肌梗死(AMI)的药效作用，发现Ast和DSS能显著减小心肌梗死范围，组合给药能更显著地减小梗死范围。进一步的转录组学分析结果表明，免疫炎症、血管生成、心室重构和心肌修复、能量代谢等可能是四个成分发挥多靶点、多途径整合协同作用对抗AMI的关键生物学途径;
　　4、采用H9C2心肌细胞缺氧、氧化应激损伤模型，研究四个主要成分对心肌细胞的协同保护作用。Ast，DSS和Rg1能对抗H9C2缺氧损伤及氧化应激损伤，四个成分的低浓度组合给药能协同增强抗心肌细胞缺氧损伤作用;
　　5、采用LPS诱导RAW264.7炎症反应模型，研究四个主要成分的协同抗炎作用。研究发现倍半萜烯类成分ENL、SDL和RDL对LPS诱导NO分泌具有不同程度的抑制作用。DSS和Rg1两成分组合能协同增强对抗LPS诱导的NO分泌，且这一作用能被HO-1特异性抑制剂ZnPPIX减弱甚至取消。四个成分组合给药可以显著性地增强对LPS诱导NO分泌的抑制作用。

目录

声明

致谢

缩略词中英文对照表

摘要

第一章 绪论

1．1 组学技术用于中药复方药效作用及其机制研究的进展

1．1．1 基因芯片技术在中药复方药效作用及机制研究中的应用

1．1．2 蛋白质组学技术在中药复方药效作用及机制研究中的应用

1．1．3 代谢组学技术在中药复方药效作用及其机制研究中的应用

1．2 网络药理学方法概述及其用于中药复方作用机制的研究

1．2．1 网络药理学概述

1．2．2 网络药理学应用于中药复方的作用机制研究

1．3 芪参益气方基础实验研究及现代临床应用研究的现状

1．3．1 基础实验研究

1．3．2 临床应用研究

1．3．3 小结

1．4 本论文研究对象、研究思路和组织结构

第二章 冠心病疾病网络的构建及分析

2．1 方法和材料

2．1．1 文本挖掘CHD相关基因

2．1．2 人工阅读文献提取CHD相关基因

2．1．3 挖掘公共数据库CHD相关基因

2．1．4 不同来源的CHD相关基因整合

2．1．5 提供本地化文献查询功能

2．1．6 增加PPI网络拓展功能

2．1．7 优化网站运算性能

2．1．8 冠心病疾病网络构建及分析

2．2 结果及讨论

2．2．1 网络拓扑学属性分析

2．2．2 子网络／子簇聚类分析

2．2．3 生物功能GO分析

2．3 本章小结

第三章 芪参益气方主要成分对疾病网络的作用研究

3．1 方法与材料

3．1．1 芪参益气方主要成分作用靶点整理

3．1．2 药物-疾病网络构建及分析

3．2 结果及讨论

3．2．1 药物-疾病网络

3．2．2 药物-疾病网络分析

3．3 本章小结

第四章 芪参益气方主要成分抗大鼠急性心梗协同作用机制的转录组学研究

4．1 材料与试剂

4．1．1 实验动物

4．1．2 实验试剂

4．1．3 实验仪器

4．1．4 试剂的配制

4．2 实验方法

4．2．1 动物模型的制作、分组及给药

4．2．2 动物心肌组织取材及心肌梗死范围评价

4．2．3 基因芯片用大鼠心肌组织取材

4．2．4 样品总RNA转录组基因芯片检测及数据分析

4．2．5 数据统计

4．3 实验结果

4．3．1 芪参益气方及四个主要有效成分对大鼠心肌梗死范围的影响

4．3．2 基因调控分析

4．3．3 信号通路富集分析

4．4 讨论

4．4．1 心肌梗死范围评价

4．4．2 基因生物学功能分析

4．4．3 信号通路富集分析

4．5 本章小结

第五章 芪参益气方主要成分对心肌细胞的协同保护作用研究

5．1 材料与试剂

5．1．1 细胞株

5．1．2 实验试剂

5．1．3 实验仪器

5．1．4 试剂的配制

5．2 实验方法

5．2．1 心肌细胞H9C2培养方法

5．2．2 心肌细胞H9C2缺氧损伤

5．2．3 心肌细胞H9C2叔丁基双氧水氧化损伤

5．2．4 MTT法评价H9C2细胞活力

5．2．5 CTG法评价H9C2细胞活力

5．2．6 四个主要成分对H9C2细胞活力的影响

5．2．7 四个主要成分抗H9C2细胞缺氧损伤的协同作用研究

5．2．8 基于细胞ATP定量评价四个成分抗H9C2细胞缺氧损伤的作用

5．2．9 t-BHP损伤H9C2心肌细胞浓度选择

5．2．10 四个主要成分对t-BHP损伤H9C2细胞的协同保护作用研究

5．2．11 基于细胞ATP含量评价黄芪甲苷和丹参素钠对t-BHP损伤H9C2细胞的协同保护作用

5．2．12 数据统计

5．3 实验结果

5．3．1 四个主要成分对H9C2细胞活力的影响

5．3．2 四个主要有效成分抗H9C2细胞缺氧损伤的协同作用研究

5．3．3 基于细胞ATP定量评价四个成分对H9C2细胞缺氧损伤的影响

5．3．4 t-BHP对H9C2心肌细胞损伤浓度的选择

5．3．5 四个成分对t-BHP损伤H9C2心肌细胞的协同保护作用

5．3．6 基于细胞ATP定量评价黄芪甲苷和丹参素钠合用抗t-BHP损伤H9C2心肌细胞的协同保护作用

5．4 讨论

5．5 本章小结

第六章 芪参益气方主要成分抗炎的协同作用研究

6．1 材料与试剂

6．1．1 细胞株

6．1．2 实验试剂

6．1．3 实验仪器

6．1．4 试剂的配制

6．2 实验方法

6．2．1 RAW264．7小鼠单核巨噬细胞培养方法

6．2．2 MTT法评价RAW264．7细胞活力

6．2．3 一氧化氮(Nitric oxide，NO)检测

6．2．4 蛋白浓度定量

6．2．5 考察成分对RAW264．7细胞活力的影响

6．2．6 考察成分对LPS诱导RAW264．7细胞产生NO的抑制作用

6．2．7 工具药小分子U0126，T0070907，和Pioglitazone hydrochloride(Pio)对LPS刺激RAW264．7分泌NO的影响

6．2．8 Western Blot实验

6．2．9 丹参素钠、人参皂苷Rg1对LPS诱导RAW264．7分泌NO的协同抑制作用研究

6．2．10 丹参素钠、人参皂苷Rg1对LPS诱导RAW264．7分泌NO的协同抑制作用机制研究

6．2．11 四个成分合给对抗LPS刺激RAW264．7分泌NO的协同作用研究

6．2．12 数据统计

6．3 实验结果

6．3．1 ENL，RDL和SDL对RAW264．7细胞活力的影响

6．3．2 ENL，RDL和SDL对LPS诱导RAW264．7分泌NO的抑制作用

6．3．3 ENL，RDL和SDL对ERK1／2，phospho-ERK1／2，PPARγ和HO-1表达的影响

6．3．4 U0126，T0070907和Pio对LPS诱导RAW264．7分泌NO的影响

6．3．5 丹参素钠、人参皂苷Rg1对LPS诱导RAW264．7分泌NO的协同抑制作用

6．3．6 丹参素钠、人参皂苷Rg1对LPS诱导RAW264．7分泌NO的协同抑制作用机制

6．3．7 四个成分对LPS诱导RAW264．7分泌NO的协同抑制作用

6．4 讨论

6．5 本章小结

第七章 总结与展望

参考文献

附录

作者简历及在学期间所取得的科研成果