DNA2和TATDN1在细胞核和线粒体内的功能及调控

摘要

DNA2是一种核酸酶/解旋酶，首先在酵母中被发现。作为重要的工具酶在DNA复制和修复中，参与不同的信号通路。例如在冈崎片段成熟过程中能够去除RNA引物，双链DNA断裂修复中进行末端剪切，以及最近报道的，DNA2能够稳定并重新起始鸡爪状复制叉。2008年，我们实验室首先发现人DNA2也具有保守的核酸酶和解旋酶结构域，但是缺少经典的核定位信号肽序列。所以免疫荧光和蛋白杂交实验表明，人DNA2主要定位在线粒体内而非细胞核内。体外生化实验表明，人DNA2能够移除线粒体DNA复制过程中形成的RNA引物并促进polγ合成DNA的效率。此外，人DNA2也能够参与长片段碱基切除修复过程中翼状结构的移除，从而稳定极易受到氧自由基攻击的线粒体DNA。与上述结果一致，2013年，我们与一个意大利实验室合作共同报道，一些家族性肌无力肌病患者样本中携带有几个DNA2基因的突变位点，这些位点在氨基酸水平上都是非常保守的。我们表达并纯化这些突变体，体外实验分析发现，它们具有核酸酶或者解旋酶缺陷。因此，我们推测DNA2突变很可能直接或间接导致线粒体肌病。
　　本文通过基因靶向技术构建了DNA2敲除小鼠模型。结果发现，所有的DNA2纯和敲除小鼠都是胚胎致死的，说明DNA2对于胚胎发育是必须且至关重要的，但是DNA2杂合敲除是可以存活的。让我们惊讶的是，虽然小鼠DNA2的入核信号序列也全部丢失，但是，DNA2杂合敲除小鼠表现出明显的端粒复制缺陷，例如端粒丢失，端粒断裂以及姐妹端粒互联等。体外实验表明，DNA2可以特异切割由端粒特殊重复序列TTAGGG形成的G4四联体结构，并且用G4结构稳定剂处理MEF细胞发现，这种G4结构在DNA2杂合敲除小鼠MEF细胞中更加稳定。此外，DNA2缺失会导致端粒损伤和染色体分离错误，从形成多倍体细胞。并且在DNA2杂合敲除小鼠癌症细胞中发现大量功能紊乱的端粒。翻译后修饰对于蛋白的功能调节起到重要的作用。有报道称，酵母DNA2的磷酸化可以招募DNA2到损伤位点进行DNA修复，但是关于哺乳动物DNA2的翻译后修饰还鲜有研究。当DNA受到损伤时，修复相关的蛋白被激活并富集到损伤位点进行DNA修复。本文研究了DNA2的泛素化，数据表明，DNA2与E3连接酶相互作用并被其泛素化（多聚泛素化），泛素化后的DNA2十分稳定不被蛋白酶体降解，并且我们推测，泛素化的DNA2能够帮助DNA2转运到核内进行DNA损伤修复。斑马鱼TATDN1(zTATDN1)具有内切核酸酶活性。体外生化分析，zTATDN1能够切割双链环状DNA，形成DSB。这种生化活性使得zTATDN1能够解离缠绕的kDNA成为线性DNA。进一步研究表明，zTATDN1与斑马鱼胚胎的眼睛发育有关。当降低zTATDN1的表达量会引起细胞周期异常，进而形成多倍体细胞，引起眼睛发育迟缓，偏小。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 DNA2的研究进展

1．1．1 酵母中DNA2的发现及其酶学研究

1．1．2 人类DNA2在冈崎片段成熟过程中的作用

1．1．3 人类DNA2在维持线粒体基因组稳定性中的作用

1．1．4 DNA2在维持核基因组稳定性中的作用

1．2 蛋白入核机制的研究

1．2．1 核孔复合体

1．2．2 入核信号

1．2．3 分子机制

1．3 泛素化

1．4 泛素化调控蛋白的稳定性与核定位

1．5 TATDN1的研究背景

本文的理论依据和研究意义

第二章 哺乳动物DNA2在细胞核和线粒体内的功能及调控

2．1 材料和方法

2．1．1 表达质粒的构建

2．1．2 蛋白的表达与纯化

2．1．3 DNA2突变体的构建与表达

2．1．4 细胞组分分离实验

2．1．5 G4底物及G4切割分析

2．1．6 Polγ活性的分析

2．1．7 免疫共沉淀(Co-IP)和亲和沉淀分析

2．1．8 染色质免疫共沉淀(CHIP)

2．1．9 免疫荧光分析

2．1．10 原位杂交(FISH)和共原位杂交(Co-FISH)

2．1．11 免疫荧光原位杂交(IF-FISH)

2．1．12 RNA干扰(siRNA)

2．1．13 DNA2杂合敲除小鼠模型的构建

2．1．14 组织病理学

2．2 结果与分析

2．2．1 DNA2主要定位在线粒体内而非核内

2．2．2 DNA2与polγ相互作用并促进其DNA合成的效率

2．2．3 线粒体肌病病人样本中DNA2突变体的发现

2．2．4 DNA2突变体影响其核酸酶／解旋酶活性

2．2．5 DNA2+／-杂合敲除小鼠的构建与鉴定

2．2．6 DNA2缺失引起癌症的发生

2．2．7 DNA2+／-MEF细胞具有端粒缺失、姐妹染色体交换等表型

2．2．8 哺乳动物细胞中的DNA2在端粒上有分布

2．2．9 体外生化实验分析DNA2切除不同结构G-四联体的效率

2．2．10 G4稳定剂显著增加DNA2+／-MEF细胞中端粒缺失的概率

2．2．11 DNA2缺失引起端粒损伤以及染色体分离缺陷

2．2．12 DNA2+／-杂合敲除小鼠癌组织中端粒变短及DNA加倍

2．2．13 DNA2与E3连接酶TRAF6相互作用

2．2．14 体内及体外实验证明DNA2能被TRAF6泛素化

2．2．15 TRAF6能够稳定DNA2蛋白使其不被降解

2．2．16 TRAF6通过泛素化介导DNA2结合到染色质上

2．2．17 DSB介导DNA2入核进行DNA修复

2．3 讨论

第三章 TATDN1在斑马鱼眼发育过程中调控染色体分离及细胞周期进程

3．1 材料与方法

3．1．1 重组蛋白的表达与纯化及多克隆抗体的制备

3．1．2 核酸酶活性和DNA分离分析

3．1．3 斑马鱼整体原位杂交(WISH)

3．1．4 反义核酸技术和显微注射

3．1．5 Edu的显微注射及免疫荧光染色

3．1．6 流式细胞技术检测胚胎细胞的周期和细胞遗传学观察

3．2 结果与分析

3．2．1 重组zTATDN1及突变体蛋白的纯度以及抗体验证

3．2．2 斑马鱼TATDN1(zTATDN1)可以切割超螺旋质粒DNA

3．2．3 斑马鱼TATDN1(zTATDN1)可以解离kDNA

3．2．4 zTATDN1mRNA在斑马鱼胚胎不同发育阶段的分布

3．2．5 zTATDN1的缺失抑制了细胞周期的进程导致斑马鱼眼细胞多倍体的形成

3．2．6 zTATDN1缺失影响斑马鱼眼睛发育

3．3 讨论

总结与展望

参考文献

作者简历