菜蛾盘绒茧蜂寄生对小菜蛾幼虫神经肽转录水平的影响

摘要

本论文首先在分析实验室已有的小菜蛾幼虫脑转录组数据基础上，应用表达序列标签(expressed sequence tag，EST)序列验证的方法鉴定出分属于17个神经肽家族的19个小菜蛾神经肽基因，通过cDNA末端快速克隆（rapid-amplification of cDNA ends，RACE）方法获得了其中13个基因的全长;其次应用荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测了这些神经肽基因在小菜蛾幼虫不同发育阶段的转录规律以及菜蛾盘绒茧蜂寄生/假寄生对这些神经肽基因转录的影响。现将结果总结如下:
　　1)小菜蛾幼虫脑神经肽家族基因的鉴定
　　对小菜蛾幼虫脑转录组数据进行Blastx分析，筛选出能匹配到昆虫神经肽基因的21个EST序列并逐一克隆验证，然后用RACE法获得包括Adipokinetic hormoneⅠ、Adipokinetic hormoneⅡ、Allatostatin A、Allatostatin C、CCHamide、Bursiconα、Bursiconβ、Crustacean cardioactivepeptide、 Ion transport peptide、 Neuroparsin、Neuropeptide F、Prothoracicotropic hormone和Allatotropin在内的13个神经肽基因的cDNA全长，获得Short neuropeptide F、Diuretic hormone、FMRFamid、Tachykinin、Neuropeptide-likepeptide和Leucokinin在内的6个基因的3'端序列。
　　2)小菜蛾幼虫神经肽基因在小菜蛾幼虫不同发育阶段的转录规律
　　通过qRT-PCR的方法对小菜蛾19个神经肽基因在小菜蛾幼虫不同发育阶段的转录模式进行了检测。结果表明，小菜蛾19个神经肽基因在不同发育历期的总体转录规律是:在每个龄期的末期存在一个转录高峰。
　　3)菜蛾盘绒茧蜂寄生/假寄生对小菜蛾幼虫神经肽基因转录的影响
　　通过qRT-PCR的方法对菜蛾盘绒茧蜂寄生/假寄生后的小菜蛾幼虫神经肽基因转录水平的影响进行分析。结果表明在寄生后小菜蛾幼虫神经肽基因的转录趋势可以分成上调型和下降型，而假寄生后的转录趋势可以分成平稳型和波动型。即在菜蛾盘绒茧蜂寄生后，Adipokinetic hormoneⅠ、Adipokinetic hormoneⅠ、Allatostatin A和AllatostatinC等15个小菜蛾神经肽基因在幼虫脑部的转录趋势属于下降型，而Neuropeptide-like peptide、Neuroparsin、Leucokinin和I0n transport peptide属于上调型;菜蛾盘绒茧蜂假寄生后，Adipokinetic hormoneⅠ、Allatostatin A、CCHamide和Ion transport peptide等14个神经肽基因在幼虫脑部的转录趋势属于平稳型，而Leucokinin、Adipokinetic hormoneⅡ、AllatostatinC和Bursiconα属于波动型。

目录

声明

论文说明

致谢

前言

摘要

第一章 文献综述

1 昆虫神经系统

2 昆虫神经肽定义

3 昆虫神经肽种类

4 昆虫神经肽的分布

5 昆虫神经肽的生理功能

5．1 神经肽与昆虫蜕皮作用

5．2 神经肽与昆虫的取食活动

5．3 神经肽与水和高子平衡

5．4 神经肽调控昆虫的羽化作用

5．5 神经肽与昆虫性信息素

6 寄生蜂对寄主的调控作用

第二章 基本材料与方法

1 养虫设备

1．1 全自动人工气候室

1．2 智能人工气候箱

1．3 养虫笼

1．4 产卵笼

1．5 保蜂盒及寄生盒

1．6 吸虫管

2 供试材料

2．1 供试蔬菜

3 供试昆虫的人工饲养

3．1 虫源

3．2 小菜蛾的饲养

3．3 菜蛾盘绒茧蜂的饲养

4 实验仪器及软件系统

4．1 实验仪器

4．2 软件系统

5 常用实验试剂及配制

5．1 工具酶及试剂盒

5．2 其它试剂

5．3 常用试剂的配制

6 常规实验方法

6．1 小菜蛾幼虫脑组织的收集

6．2 小菜蛾幼虫脑组织总RNA的提取

6．3 第一链cDNA的合成

6．4 琼脂糖凝胶电泳

6．5 琼脂糖凝胶回收

6．6 连接反应

6．7 感受态细胞的制备

6．8 转化与活化

6．9 质粒提取

6．10 脑转录组中EST序列的筛选

6．11 EST序列的PCR验证

6．12 3’、5’末端快速扩增(RACE)

6．13 荧光定量PCR

第三章 小菜蛾幼虫脑组织神经肽基因克隆与序列分析

1．材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 脑组织总RNA的提取

1．3 cDNA第一链的合成

1．6 序列验证

1．7 RACE扩增

1．8 序列分析

2．结果与分析

2．1 Adipokinetic hormoneⅠ全长cDNA序列分析

2．2 Adipokinetic hormoneⅡ全长cDNA序列分析

2．3 Allatostatin A全长cDNA序列分析

2．4 Allatostatin C全长cDNA序列分析

2．5 CCHamide全长cDNA序列分析

2．6 Bursicon α全长cDNA序列分析

2．7 Bursicon β全长cDNA序列分析

2．8 Crustacean cardioactive peptide全长cDNA序列分析

2．9 Ion transport peptiede全长cDNA序列分析

2．10 Neuroparsin全长cDNA序列分析

2．11 Neuropeptide F全长cDNA序列分析

2．12 Prothoracicotropic hormone全长cDNA序列分析

2．13 Allatotropin全长cDNA序列分析

3 讨论

第四章 菜蛾盘绒茧蜂寄生／假寄生对小菜蛾幼虫神经肽转录水平的影响

1 材料与方法

1．1 供试昆虫来源

1．2 菜蛾盘绒茧蜂寄生／假寄生的方法

1．3 不同处理脑组织样品的收集

1．4 小菜蛾幼虫脑部RNA的提取及cDNA第一链的合成

1．5 实时荧光定量qRT-PCR检测

2 结果与分析

2．1 实时定量PCR引物的特异性与扩增效率

2．2 神经肽基因在不同发育阶段的转录规律

2．3 寄生／假寄生作用对小菜蛾神经肽转录规律的影响

2．5 寄生与假寄生的转录规律水平比较

2．6 讨论

第五章 总结与讨论

参考文献