核诱变和盐度驯化硅藻生长富集油脂的机理研究

摘要

微藻吸收太阳能以制备生物柴油等清洁能源对于解决当前石油等化石能源的污染严重和日益短缺的危机与矛盾具有非常重要的意义。硅藻在生长速度和油脂含量上具有很大的竞争优势，成为国内外制取生物柴油的研究热点。本文重点研究了核诱变和盐度驯化硅藻生长富集油脂的反应过程，分析了藻种经历核诱变、盐度胁迫以及缺氮缺硅前后的关键基因变化，揭示了硅藻生长富集油脂的代谢通路调控机理。
　　本文以菱形藻Nitzschia sp.为主要研究对象，首先采用60Co-γ射线核诱变和高盐度驯化方法，提高了菱形藻生长富集油脂能力。实验发现核辐射剂量为900Gy时筛检得到的菱形藻突变体的生物质密度比野生藻种增加了53.8％，油脂干重产量提高了28.1％。对菱形藻突变体通过30‰高盐度的梯度驯化，细胞内油脂含量由11.8％提高到27.20％。当培养基中同时缺N和缺Si时，此突变优势藻株（Nitzschia ZJU1）的油脂含量提高到51.22％。针对藻株Nitzschia ZJU1进行了转录组的测序和不同盐度条件下细胞中基因表达图谱的测定，并对参与脂肪酸和TAG的生物合成代谢途径进行了重建。实验发现在海水培养藻Nitzschia ZJU1中，脯氨酸、ABC转运蛋白、蛋白酶体、谷胱甘肽、碳的固定、氮素代谢的通路均有较大差异。在脂类代谢相关的几个通路中，乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、β-酮脂酰-ACP合酶Ⅰ和Ⅱ和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)等关键基因的表达量有所上调。
　　本文利用137Cs-γ射线对经60Co-γ射线诱变选育后的高产油突变藻株Nitzschia ZJU1进行二次核辐射，利用尼罗红荧光方法筛选获得两株单细胞的高产油突变藻株Nitzschia ZJU2和Nitzschia ZJU3，其油脂产量相比于藻株NitzschiaZJU1由209.90 mg/L分别提高到245.52mg/L和311.60mg/L。利用Illumina测序平台进行藻Nitzschia sp.细胞的转录组测序，分析了原始Nitzschia sp.藻株和通过两次诱变后筛选出的具有生长快、产油高优势的藻株Nitzschia ZJU2与脂质合成相关的代谢通路和基因表达情况。发现与细胞生长、碳水化合物以及蛋白质合成相关的9条代谢通路发生明显变化;参与脂质合成的相关基因，如ACCase、DGAT等关键基因的表达均有明显上调，这些代谢通路的变化以及基因表达的上调促进了细胞的生长以及脂类的合成，提高了细胞的油脂产量。另外，通过单核苷酸多态性的分析发现藻株Nitzschia ZJU2中有40795个非同义突变，这也发映出核辐射对于藻株突变的影响。
　　本文对二次诱变藻种通过培养基缺氮缺硅和加磷调控突变体生长的油脂含量，将Nitzschia ZJU2和Nitzschia ZJU3的油脂含量由22.57％分别提高到55.21％和53.66％。并且其所制备的生物柴油多不饱和脂肪酸含量降低，热值可达41.50MJ/kg。同时本文对缺N和缺Si培养条件下的藻株进行基因表达谱的测定，发现同时缺N和缺Si培养条件下有4，598个基因表达量下调，3，063个基因表达量上调，其中乙酰辅酶A羧化酶等许多与脂类合成相关的基因表达量显著上调。
　　本文首次选用可调角度式的封闭式平板光生物反应器（容积30L）对二次诱变藻株Nitzschia ZJU2进行中试实验。采用优化培养基得到硅藻生物质产量为1.73g/L，进行缺氮缺硅胁迫调控使细胞油脂含量从17％提高到50％，提取油脂制取生物柴油的热值达到40MJ/kg。说明了二次诱变藻株Nitzschia ZJU2具有生长快和含油高的优势、以及良好的遗传稳定性。

目录

声明

致谢

前言

摘要

1 绪论

1．1 微藻富集油脂制取生物柴油的意义

1．1．1 生物柴油研究的背景

1．1．2 微藻富集油脂制取生物柴油的优势及意义

1．2 微藻生长富集油脂的研究现状

1．2．1．产油藻种的筛选

1．2．2．微藻生长因素的调控

1．2．3．微藻油脂合成的代谢机理

1．3 硅藻生长富集油脂制取生物柴油的可行性分析

1．3．1．硅藻生长富集油脂制取生物柴油的可行性

1．3．2．微藻富集油脂制取生物柴油的技术难点

1．4 本文研究的目的和内容

1．4．1．研究目的

1．4．2．研究内容

2 实验材料和方法

2．1 硅藻核辐射诱变及筛选实验

2．1．1 藻种与培养基

2．1．2 核辐射诱变

2．1．3 诱变突变体筛选方法

2．1．4 实验仪器

2．2 藻株盐度驯化及宏观调控实验

2．2．1 菱形藻突变体高盐度梯度驯化

2．2．2 优势突变藻株Nitzschia ZJU1缺氮缺硅培养提高油脂含量

2．2．3 优势突变藻株Nitzschia ZJU1培养基优化实验

2．2．4 优势突变藻株Nitzschia ZJU2和Nitzschia ZJU3培养基优化实验

2．2．5 突变藻株Nitzschia ZJU2和Nitzschia ZJU3缺氮缺硅提高油脂含量

2．3 藻株细胞内各成分测定方法

2．3．1 硫酸-蒽酮比色法测定细胞内碳水化合物含量

2．3．2 考马斯亮蓝比色法测定细胞内蛋白质含量

2．3．3 改进的Bligh-Dyer提取油脂方法测定细胞油脂含量

2．3．4 实验设备

2．4 藻株转录组及基因测序方法

2．4．1 藻种的鉴定

2．4．2 cDNA文库构建和Illumina测序

2．4．3 序列拼接和注释

2．4．4 差异表达基因的分析

2．4．5 SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)分析

2．5 生物柴油的制备与特性分析

2．5．1 生物柴油的制备

2．5．2 元素分析

2．5．3 气相色谱分析

2．5．4 热天平实验

2．6 多通道封闭式平板光反应器

3 60Co-γ射线一次诱变以及高盐度驯化提高硅藻油脂含量

3．1 引言

3．2 60Co-γ射线核诱变选育硅藻藻突变体

3．2．1 适合核诱变的藻种的确定

3．2．2 选育菱形藻突变体

3．3 菱形藻突变体高盐度梯度驯化

3．4 驯化藻种Nitzschia ZJU1的生长富集油脂优化调控

3．5 诱变驯化藻种缺氮缺硅培养的细胞有机成分比较

3．6 本章小结

4 一次诱变藻株在不同盐度条件下基因表达与代谢通路分析

4．1 引言

4．2 Nitzschia ZJU1转录组拼接、注释概述

4．3 参与细胞壁的生物合成基因的鉴定

4．4 TAG生物合成途径的重建

4．5 盐度胁迫下细胞代谢通路差异分析

4．6 盐度胁迫下脂质合成相关基因的差异表达

4．7 碳、氮代谢的影响

4．8 代谢通量的变化的qRT-PCR验证

4．9 本章小结

5 137Cs-γ射线二次诱变以及培养基优化提高硅藻油脂产量

5．1 引言

5．2 藻株Nitzschia ZJU1光照强度、接种密度优化

5．3 尼罗红染色荧光显微镜筛选方法的条件校正

5．4 二次核诱变单细胞藻株的荧光显微筛选及油脂测定

5．5 突变藻株生长调控及缺氮缺硅提高油脂含量

5．6 1％浓度CO2培养实验

5．7 本章小结

6 硅藻经历两次诱变后的基因表达与代谢通路分析

6．1 引言

6．2 硅藻经历两次诱变前后的生长情况

6．3 藻种的分子鉴定

6．4 转录组测序、拼接和注释的对比

6．5 核诱变前后与细胞生长相关的基因表达比较

6．6 与脂类合成相关基因的变化

6．7 SNP分析

6．8 本章小结

7 二次诱变藻株缺N缺Si下富集油脂的基因表达与代谢通路分析

7．1 引言

7．2 转录组测序、拼接和注释

7．3 基因表达情况的比较

7．4 细胞代谢的变化

7．5 与油脂合成相关的基因的表达差异

7．6 与油脂合成相关的基因的qRT-PCR验证

7．7 本章小结

8 硅藻生物柴油的燃料特性

8．1 引言

8．2 元素分析

8．3 GC成分分析

8．4 热天平燃烧特性分析

8．5 本章小结

9 多通道平板式光反应器培养二次诱变藻株的中试研究

9．1 引言

9．2 30L多通道平板式养藻反应器装置

9．3 计算流体力学(CFD)数值模拟及模型的选取

9．3．1 CFD数值模拟

9．3．2 CFD模型的选取

9．4 Fluent模拟与高速摄像结果

9．4．1 Fluent模拟网格的无关性检验

9．4．2 Fluent模拟收敛性分析

9．4．3 流场计算模型中通气率参数的试验确定

9．4．4 流场模型计算结果的分析讨论

9．5 30L多通道平板式养藻反应器培养Nitzschia ZJU2的实验结果

9．5．1 Nitzschia ZJU2生长情况

9．5．2 Nitzschia ZJU2油脂含量及其生物柴油成分分析

9．6 本章小结

10 全文总结

10．1 主要研究成果

10．2 主要创新点

10．3 研究展望

参考文献

作者简历