球孢白僵菌五种液泡钙离子交换子蛋白差异调节钙调磷酸酶依赖型Ca2+/Mn2+耐受力、多胁迫应答及毒力

摘要

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是典型的丝状昆虫病原真菌之一，在农业害虫的生物防治中扮演举足轻重的角色，其适应昆虫寄主及其环境的能力在很大程度上决定着菌剂的田间应用效果。这样的能力往往依赖于真菌细胞的胁迫反应机制，而研究破解具有细胞结构的侵染体对不同类型胁迫的响应机制，是理解白僵菌等昆虫病原真菌生物防治潜能形成机制的基本切入点。
　　许多丝状真菌都有液泡钙离子交换子(vacuolar calcium exchanger)同源蛋白Vcx1，它们的生物学功能远不及模式酵母Vcx1的功能那样清楚。通过比对酿酒酵母Vcx1的序列，球孢白僵菌基因组中存在5个Vcx1同源物(Vcx1 A-E)，其蛋白序列有两个保守的Na Ca Ex核心结构域，都符合Na+/Ca2+交换子大家族(Na+/Ca2+exchangers superfamily)成员的特征。通过构建单基因敲除株(△vcx1)和回补株(△vcx1/vcx1)并进行表型和生化分析，作者解析了球孢白僵菌5个Vcx1同源蛋白的功能及其在胁迫反应中的作用。
　　五个Vcx1同源蛋白在维持白僵菌胞内钙离子稳态方面发挥着程度不同的作用，因而对毒力和抗逆性状有不同的贡献。首先，敲除任意vcx1基因，都会显著上调其余4个vcx1基因和6个P型Ca2+-ATP激酶基因的转录水平，导致部分敲除株无论有无Ca2+胁迫刺激在25℃和30℃下胞内Ca2+浓度显著上升或下降。常温25℃下用环孢霉素A抑制钙调磷酸酶(calcineurin)活性的结果是，5个vcx1敲除株对Ca2+胁迫的敏感性上升11-17％，但只有△vcx1A和△vcx1D两个高敲除株对Mn2+更敏感。后两个敲除株在钙调磷酸酶不失活的30℃下也表现更高的Ca2+敏感性，但在钙调磷酸酶失活的25和30℃下仅表现轻微的生长缺陷。其次，5个△vcx1敲除株都对内质网压抑制剂(二硫苏糖醇DTT)和细胞壁抑制剂（刚果红）有高敏感性;有3个敲除株的抗氧化能力减弱，表现为对氧化剂甲萘醌和H2O2的敏感性升高。在对大蜡螟(Galleriamellonella)幼虫的生物测定中，除△vcx1E之外，4个敲除株的毒力下降了15-40％。例外地，只有△vcx1E的分生孢子对45℃高温的耐受力显著下降。敲除株的所有这些表型变化在回补株中都很好地恢复到野生株的水平。
　　综上所述，5个Vcx1同源蛋白不同程度地参与调节球孢白僵菌依赖于钙调磷酸酶的Ca2+/Mn2+抗性，多胁迫响应和毒力。这些结果深化了丝状真菌钙离子交换子与钙调信号通路间相互关系及其抗逆机理的认识。

目录

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论文说明

致谢

摘要

1 真菌钙信号的研究现状和意义

1．1 钙离子信号通路组成及主要特征

1．2 Ca2+／H+交换子结构与功能

1．3 P型Ca2+-ATP激酶的分类及功能

1．4 展望

2 球孢白僵菌Vcx1同源蛋白的功能解析

2．1 材料

2．1．1 菌株和培养条件

2．1．2 供试试剂

2．2 方法

2．2．1 DNA和RNA提取

2．2．2 球孢自僵菌Vcx1A～E基因克隆及序列分析

2．2．3 单基因敲除与回补菌株的构建与鉴定

2．2．4 各鼓除株中关联基因转录水平的测定

2．2．5 表型分析

2．2．6 真菌毒力测定

2．2．7 数据的统计分析

2．3 结果与分析

2．3．1 球孢白僵菌与其它真菌中Vcx1同源蛋白的比较

2．3．2 单基因vcx1敲除影响其余vcx1基因和P型钙离子激酶基因的荣录表达

2．3．3 敲除株胞内Ca2+浓度变化

2．3．4 单基因敲除vcxl对孢子萌发、生长及产孢的影响

2．3．5 单基因敲除株对Ca2+、Mn2+、CsA和DTT胁迫的应答反应

2．3．6 五个Vcx1同源蛋白在宿主菌多胁迫应答和寄主便染中的作用

2．4 讨论

3 结语

参考文献