果蝇内吞蛋白Shibire对细胞自噬调节机制的研究

摘要

细胞在新陈代谢的过程中，会产生一些损伤的蛋白质或细胞器，这些受损的蛋白或细胞器必须及时被清除，否则，将影响细胞正常的代谢活动。细胞自噬是生物体内清除代谢废物的重要途径之一，研究表明，细胞自噬的异常与多种人类疾病如神经退行性疾病、心脏病、肝脏病、早衰等息息相关，因此，探究细胞自噬的机理对人类的健康有重要意义。
　　本研究以果蝇为模型，利用甲磺酸乙酯(EMS)诱变法诱变果蝇，从大约1200种X染色体突变的果蝇中筛选发现，shibire(shi)突变导致细胞自噬的异常，且其异常并不是发生在细胞自噬的起始或自噬小体与溶酶体的融合过程，而是致使溶酶体酸性降低。研究发现，shi突变引起溶酶体功能的障碍主要是由溶酶体蛋白如氢离子泵亚基的转运障碍引起。同时，shi突变导致的溶酶体功能障碍并不依赖于细胞自噬的诱导。除shi，其它内吞元件clathin，AP1，AP2对细胞自噬也有类似但并不完全一致的调节作用。
　　之前的研究表明，Dynamin通过它的剪切功能直接参与自噬小体的形成且参与细胞自噬后期溶酶体再生的过程。在我们的研究中发现，Dynamin也通过参与溶酶体蛋白的转运以及mTOR信号的再激活过程调节细胞自噬的进程。

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致谢

摘要

缩略语

1 引言

1．1 果蝇模式生物

1．2 细胞自噬

1．2．1 细胞自噬途径

1．2．2 细胞自噬调节

1．3 细胞内吞

1．4 Dynamin研究进展

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要仪器

2．1．2 实验耗材

2．1．3 实验用的的果蝇品系

2．1．4 实验用的抗体

2．1．5 实验相关试剂配方

2．2 实验方法

2．2．1 X染色体致死基因平衡系的建立

2．2．2 FRT/FLP系统

2．2．3 重组嵌合体

2．2．4 MARCM技术

2．2．5 抽提果蝇基因组DNA

2．2．6 多聚酶链式反应PCR

2．2．7 琼脂糖凝胶电泳

2．2．8 DNA片段切胶回收

2．2．9 限制性内切酶切割DNA

2．2．10 酶切产物纯化

2．2．11 T4 ligase的连接反应

2．2．12 重组质粒转化感受态细胞

2．2．13 质粒DNA批量抽提

2．2．14 S2细胞培养

2．2．15 转染

2．2．16 果蝇脂肪体组织活细胞染色

2．2．17 果蝇三龄幼虫脂肪体组织免疫荧光染色

2．2．18 NRK细胞免疫荧光及活细胞染色

2．2．19 Western blot检测

2．2．20 透射电子显微镜样品制备

3 结果与分析

3．1 果蝇突变体XG12O，XG12A中细胞的酸性明显降低

3．2 XG12O与XG12A果蝇中shibire发生突变

3．3 shi对细胞自噬的调节

3．3．1 sh-/-导致细胞自噬缺陷

3．3．2 shi突变细胞中自噬底物进入溶酶体过程正常

3．3．3 shi影响溶酶体上氢离子泵亚基的转运

3．3．4 shi突变导致溶酶体降解障碍不依赖于细胞自噬

3．4 其它内吞元件对细胞自噬的调节

3．4．1 clathin与shi细胞自噬调节机制一致

3．4．2 AP-1-2β、AP-2α、EPS15的细胞自噬调节机制

3．5 哺乳动物细胞中shi同源基因对细胞自噬调节

3．5．1 抑制Dynamin溶酶体酸性明显降低

3．5．2 抑制Dynamin活性导致LC3积累

3．5．3 抑制Dynamin活性导致自噬溶酶体结构膨大

3．5．4 Dynamin参与mTOR信号的再激活

4 讨论

4．1 shi通过参与溶酶体蛋白V-ATPase的转运影响溶酶体的功能

4．2 不同的内吞元件对细胞自噬有不同的调节机制

4．3 shi对自噬的调节作用在哺乳动物中是保守的

4．4 shi参与细胞自噬后期mTOR信号的再激活

5 结论

参考文献

作者简历