三种手性农药对映体选择性种间CYP450代谢差异研究

摘要

研究背景:手性农药的广泛使用，使其不可避免的进入到各种环境系统，进而可通过各种介质和途径进入生物体内，造成伤害。同一手性农药的不同对映体，由于生化特性的不同，进入环境后往往具有不同的环境行为，其对生物及人体的生理作用也具有对映体选择性差异，从而导致一系列截然不同急慢性毒性作用。但长期以来，外消旋的手性农药都被当作一种化合物来研究其环境行为和生态毒性效应。近年来有关手性农药对映体选择性环境毒性的研究已经引起了人们的热切关注。另外，由于不同物种对进入其体内的手性化合物的对映体选择性降解存在明显的种间差异，导致其在不同物种体内呈现不同的浓度和ER值，从而造成的急慢性毒性效应也会存在种间差异。当前的研究已经关注到这一现象，但没有深入探讨，关于手性农药对映体选择性种间代谢差异的原因，也未见报道。
　　研究方法:实验选取目前世界上使用最为广泛，且能代表杀虫、除草和杀菌三种主要类型的手性农药:氟虫腈、禾草灵和甲霜灵为研究对象，以人肝癌细胞系(HepG2)、大鼠肝癌细胞系(H4IIE)、鸡肝癌细胞系(LMH)和草鱼肝脏细胞系(L8824)这几种能代表高等脊椎动物的细胞系为研究模型。分别研究这三种手性农药在上述物种细胞内代谢时主要的CYP450酶的诱导情况，看是否存在明显的种间差异。进而以甲霜灵为例，用UPLC-MS/MS测定其经过这四种细胞代谢24h后的残留及ER值的变化情况，比较其对映体选择性种间代谢差异，和上述酶活实验结果的种间差异性相互映证。并通过添加不同的CYP450的特异性抑制剂，来进一步验证上述对映体选择性种间代谢差异的产生与特定的CYP450酶被诱导之间的关系。
　　研究结果:酶活实验中，不同的手性农药在同种物种细胞内代谢时，细胞内主要的CYP450酶的诱导情况是不一样的，且同种手性农药在不同物种细胞体内代谢时，诱导的CYP450酶的种类也存在种间差异，添加特异性的CYP450抑制剂后，这些诱导的酶活可以得到相应的抑制。分析实验中，甲霜灵经四种物种细胞代谢后，两种对映异构体的残留和ER值的情况变化存在明显的种间差异。HepG2、H4IIE和LMH细胞选择性代谢S-甲霜灵，L8824细胞选择性代谢R-甲霜灵。并且，添加上述酶活实验中被诱导的CYP450酶的特异性抑制剂后，这些差异和变化都得到了相应的抑制。
　　研究结论:本研究表明，手性农药在不同物种细胞内代谢时存在明显的对映体选择性种间代谢差异，经过不同物种细胞代谢后，手性农药会呈现不同的ER值;并且种间代谢差异的产生与特定的CYP450酶被诱导有关，抑制相应的CYP450酶活后，这些对映体选择性种间代谢差异情况也会得到抑制。说明这些手性农药在不同物种体内可能是由不同的CYP450酶来进行对映体选择性代谢的。由于不同的物种细胞对手性农药存在对映选择性种间代谢差异，使得手性农药在不同物种体内呈现不同的浓度和ER值，进而可能对这些物种细胞造成不同的毒性作用，所以在评价手性农药的生态风险时应充分考虑对映异构体的种间代谢差异。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 手性及手性农药简介

1．2 手性农药生态毒性的对映体选择性

1．3 手性农药环境行为的对映体选择性研究

1．4 手性农药在不同物种体内的对映体选择性富集、代谢行为研究

1．5 本文选用的手性农药的研究进展

1．6 细胞色素P450酶对手性农药对映体选择性种间代谢差异的影响

1．7 本文的立论依据、研究方法、目的和意义

2 实验内容和方法

2．1 实验材料

2．2 实验用主要仪器

2．3 实验方法

2．4 数据分析

3 手性农药对细胞MTT实验及曝露浓度的确定

3．1 甲霜灵对四种细胞24hMTT实验及曝露浓度的确定

3．2 禾草灵对四种细胞24hMTT实验及曝露浓度的确定

3．3 氟虫腈对四种细胞24hMTT实验及曝露浓度的确定

3．4 由MTT实验结果确定手性农药的最终曝露浓度

4 手性农药对细胞CYP450酶活的影响

4．1 甲霜灵曝露24h对四种细胞中六种CYP450酶活性的影响

4．2 禾草灵曝露24h对四种细胞中六种CYP450酶活性的影响

4．3 氟虫腈曝露24h对四种细胞中六种CYP450酶活性的影响

4．4 手性农药曝露于不同物种细胞24h后，细胞中主要CYP450酶的诱导情况小结

5 特异性抑制剂对手性农药诱导四种细胞中CYP450酶活结果的影响

5．1 特异性抑制剂及抑制浓度的确定

5．2 特异性抑制剂对甲霜灵诱导四种细胞中CYP450酶的影响

5．3 特异性抑制剂对禾草灵诱导四种细胞中CYP450酶的影响

5．4 特异性抑制剂对氟虫腈诱导四种细胞中CYP450酶的影响

5．5 特异性抑制荆对手性农药诱导四种细胞中CYP450酶活结果的影响小结

6 甲霜灵在四种细胞中的对映体选择性代谢的残留分析

6．1 甲霜灵UPLC-MS／MS分析方法的建立

6．2 甲霜灵标样的拆分及甲霜灵不同对映体的标线的确定

6．3 甲霜灵标样和不同物种细胞降解后样品的分析结果比较

6．4 甲霜灵经不同物种细胞代谢后残留量的变化情况

6．5 甲霜灵经不同物种细胞代谢后ER值的变化情况

6．6 甲霜灵在四种细胞中对映体选择性种间代谢差异小结

7 结果讨论

7．1 手性农药在不同物种肝细胞中代谢时存在明显的种间差异

7．2 手性农药在不同物种肝细胞中代谢时存在对映体选择性

7．3 利用抑制剂可以研究CYP450酶在手性农药选择性代谢中的作用

7．4 不同物种细胞对甲霜灵进行选择性代谢可能存在不同的通路

7．5 甲霜灵对映体选择性代谢种间差异产生的原因

7．6 手性农药的对映体选择性种间代谢差异影响其环境风险评价

8 实验结论及研究展望

8．1 实验结论

8．2 研究展望

参考文献

已发表的文章

致谢