猪源铁调素Hepcidin抑菌特性及其在细菌感染细胞中的作用研究

摘要

铁调素(Hepcidin)是一种兼具抗菌和调节机体铁代谢功能的抗菌肽。目前对Hepcidin调铁功能的研究已经很透彻，但是对猪源Hepcidin(Porcine Hepcidin，pHepc)的研究甚少。本试验对pHepc体外抗菌活性、抗菌机制及安全性进行了评估，并通过胞内菌和胞外菌感染猪肠道上皮细胞系IPEC-1、人结肠腺癌细胞系Caco-2和猪肺泡巨噬细胞3D4/2，探究了pHepc在细菌感染宿主细胞中发挥的作用。围绕此开展了以下试验:
　　试验一 pHepc体外抗菌活性及其机制的研究
　　试验采用琼脂糖扩散、菌落计数、透射电镜和DNA凝胶电泳阻滞方法研究了pHepc对几株常见致病菌的抗菌活性。研究发现:①人工合成的pHepc对受试菌具有抑菌活性，能够抑制所有受试菌的生长，并且存在剂量依赖效应。其中，金黄葡萄球菌ATCC25923对pHepc最敏感，最高浓度的pHepc可以减少2 log CFU/ml金黄葡萄球菌ATCC25923细菌数量。相比之下，pHepc只减少1.5 log CFU/ml其他受试菌数量。②pHepc是猪内源表达产生的，因此我们探究了不同生理基质对pHepc抑菌活性的影响。结果发现，pHepc具有广泛的pH适应条件，在pH6.0-8.0范围内可以抑制大肠杆菌K88，而对于金黄葡萄球菌能在略广的pH范围内(pH4.0-8.0)发挥抑菌活性。但是用仔猪血清处理pHepc30 min后，肽的抑菌活性丧失。③由于pHepc在调节机体铁代谢中发挥着重要功能，因此我们研究了铁对pHepc抑菌活性的影响。结果显示:pHepc在较高的铁离子浓度下仍然能发挥较强的抗菌活性，说明其抑菌活性并不依赖铁离子。
　　进一步对pHepc抑菌机制的研究发现pHepc可以提高大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌ATCC25923细菌表面疏水性。利用SYTOX摄取试验和透射电镜观察等方法揭示了pHepc同时存在膜作用机制和胞内作用机制，且对细胞膜的破坏作用存在剂量依赖性，64μg/ml的pHepc使得受试菌膜均受到一定程度的破损。pHepc作用细菌后，菌体电子密度分布不均一，两级和中间出现空泡化，细菌内容物泄露，还引起部分大肠杆菌K88菌体变长。同时还发现pHepc能够有效结合细菌质粒DNA，抑制其迁移。
　　试验二 pHepc在细菌感染宿主细胞中发挥的作用研究
　　根据试验一的结果，我们选取胞外菌大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌ATCC25923，以及胞内菌鼠伤寒沙门氏菌CMCC50013开展了细菌感染细胞试验。结果显示:pHepc在胞内菌和胞外菌感染机体中发挥不同的作用。在胞外菌感染细胞试验中，相比于细菌感染组，阴性肽pHepcC-A（将pHepc的8个半胱氨酸全部替换为丙氨酸的直链肽）没有减少受试菌粘附和入侵细胞的数量。而pHepc处理可以显著减少大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌ATCC25923的细菌数量。通过光学显微镜镜检、吉姆萨染色和扫描电镜观察，结果表明:pHepc使得大肠杆菌K88发生聚集。相反的，对于胞内菌鼠伤寒沙门氏菌CMCC50013，pHepc处理可显著增加粘附和入侵Caco-2细胞和3D4/2巨噬细胞的细菌数量。通过在不同感染时间点统计入侵菌的数量结果发现经pHepc处理后，细胞内的细菌繁殖明显增加，提示可能与胞内铁离子浓度相关。进一步的蛋白电泳结果显示，pHepc处理使细胞膜铁转运蛋白Fpn发生了部分降解，使铁的输出受到抑制从而使胞内铁浓度升高。同时，用铁螯合剂螯合细胞内铁离子后，胞内细菌数量显著减少，表明胞内菌的生长是铁依赖性的，pHepc处理后使胞内细菌快速生长确实与胞内铁离子浓度存在一定关系。鼠伤寒沙门氏菌CMCC50013感染巨噬细胞3D4/2的实验还显示，pHepc处理显著缓解感染引起的炎性细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表达量的上调(p＜0.05)。单独添加pHepc和pHepcC-A均对细胞M1型极化标志因子TNF-α、IL-6、IL-1β等分泌没有显著影响(p＞0.05)。
　　综上，本研究结果表明，pHepc在猪体内发挥着重要的抗菌功能，该研究可能对保障机体健康提供思路。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．Hepcidin的研究进展

1．1 Hepcidin的基因和结构

1．2 Hepcidin的抗菌活性和机制

1．3 Hepcidin调节机体铁代谢

2．猪源Hepcidin的研究进展

2．1．猪源Hepcidin的发现和结构

2．2．猪源Hepcidin的生物学活性

2．3．猪源Hepcidin的表达和调控

3．细菌与宿主细胞的研究进展

3．1 胞内首与胞外菌及其感染宿主细胞的过程

3．2 大肠杆菌K88与宿主细胞的研究进展

3．3 鼠伤寒沙门氏菌与宿主细胞的研究进展

4 抗菌肽在病原感染宿主细胞中的作用研究

5 研究目的和内容

5．1 研究目的

5．2 研究内容

第二章 猪源Hepcidin体外抑菌活性、机制及安全性研究

1．猪源Hepcidin抗首活性的研究

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 结果统计

1．4 结果分析

1．5 讨论

2．pHepc抑首机制及其对细胞毒性的研究

2．1 pHepc抑酋机制的研究

2．2 pHepc对真核细胞细胞毒性的研究

2．3 试验结果

2．4 讨论

第三章 猪源Hepcidin在细菌感染细胞中的作用研究

1．细胞培养

1．1 试验材料

1．2 试验试剂及仪器

1．3 细胞复苏和传代培养

2．细胞试验

2．1 裂解液Triton-x-100对细菌生长的影响

2．2 pHepc对细胞增殖和毒性的影响

2．3 培养基DMEM对pHepc抗菌活性的影响

2．4 细菌感染细胞试验

2．5 扫描电镜观察pHepc对细菌的影响

3．试验结果

3．1 Triton-x-100对细菌生长的影响

3．2 pHepc对细胞增殖和毒性影响

3．3 培养基DMEM对pHepc抗酋活性的影响

3．4 pHepc在胞外菌感染细胞中发挥的作用

3．5 pHepc在胞内首感染细胞中的作用研究结果

4．讨论

第四章 小结、创新点与研究展望

参考文献

作者简历及取得的成果