戊二醛预处理对牙本质仿生再矿化影响的研究

摘要

背景：
　　牙本质龋是口腔临床的常见病之一。矿化的胶原是牙本质最基本的结构单元。牙本质龋的发生，往往是牙本质胶原内的羟基磷灰石晶体溶解性脱矿与修复性再矿化交替发生的过程，同时伴随着胶原网状结构塌陷，脱矿的胶原纤维空间内被水分子充盈。牙本质龋引起的牙本质缺损是不可逆的损伤，若未及早发现和治疗，波及牙髓，引起牙髓炎或根尖周炎，将严重影响患者的咀嚼功能和面部美观。
　　牙本质仿生矿化则是一个应用纳米技术理论来模仿生物矿化过程的概念验证策略，利用渗透入胶原纤维内的无定形磷酸钙相变为羟基磷灰石晶体的过程来置换脱矿胶原纤维内的水分子，形成与天然牙本质在形貌、尺度和等级结构上相似的无机-有机物复合体。这种模拟生理过程的脱水机制，除了可以形成胶原纤维内的矿物并恢复其机械性能，还可以使牙本质中的内源性基质金属蛋白酶(MMPs)和半胱氨酸组织蛋白酶僵化，从而从根本上更好的保护脱矿的牙本质胶原纤维，同时达到组织重建的目的。因此，仿生再矿化是一种很有前景的牙本质修复方法，通过完成脱矿牙本质胶原的再矿化，模拟形成与天然牙本质相似的形貌、等级结构及生物学性能，最大程度的保留及重建牙体组织。本课题组前期实验已研究了脱矿牙本质的原位仿生再矿化，但存在耗时较久的问题。因此，探索一种耗时短、易操作的再矿化技术以贴近临床基本需求成为本课题亟待解决的问题。
　　戊二醛(GA)是广泛应用的交联剂，研究表明戊二醛分子对钙离子具有较强的亲和力。戊二醛为五碳双官能团分子，在分子两端各有一个醛基，能与胶原纤维表面的氨基酸残基（Lys和Hyl基团）发生交联反应。同时，醛基是羰基的一种特殊表型，通过对胶原醛基化修饰，诱导羰基于胶原表面，可促进矿化的发生。
　　目的：
　　基于戊二醛分子对胶原组织的钙化能力，本实验旨在研究戊二醛诱导的胶原交联反应对牙本质仿生再矿化的影响。本研究涉及了无定形磷酸钙对牙本质的直接修复作用;利用醛基的诱导钙化特性，发展出一种简单有效的加快牙本质矿化的方法;最后从力学和生物学性能两方面对再矿化的牙本质层进行检测，评估牙本质再修复的潜能。
　　方法：
　　1.样本制备。选取近期新鲜拔除的无龋坏第三磨牙，保存在4℃的0.1 wt％麝香草酚溶液中。所收牙齿经患者知情同意，并通过浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会审核用于实验。使用前，用高速涡轮机去净冠部牙釉质，用慢速切割机(Boeckeler Instruments，Tucson，USA)垂直于牙体长轴切除釉牙骨质界以下的牙根部分，形成牙本质块。在蒸馏水冷却下将牙本质块切成两种不同三维大小的样本:牙本质片(10.0 mm×8.0 mm×1.0 mm)，共计126个样本;牙本质条(10mm×0.8mm×0.8 mm)，共计72个样本。所获样本用35％的磷酸酸蚀10秒，牙本质脱矿深度达2～4μm厚，二蒸水冲洗，备用。
　　2.研究戊二醛分子对牙本质胶原结构的影响。通过拉曼光谱仪（Raman Analysis）分析GA与胶原的交联反应。继而将GA处理过的样本（实验组）与未GA处理（对照组）应用于脱矿牙本质的仿生再矿化对比，通过扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，SEM)、透射电镜(Transmission ElectronMicroscope，TEM)表征牙本质胶原的超微结构及矿化程度。
　　3.以临床应用为导向，将快速修复的牙本质进行力学性能和生物学性能的检测。应用纳米压痕仪(Nanoidentation)检测再矿化牙本质层的机械性能，酶解实验(Enzymatic Degradation)检测再矿化的胶原，测试矿化对生物降解的抵抗作用，评估矿物对胶原的保护能力。
　　结果：
　　1.拉曼检测结果表明，5％GA与脱矿牙本质层反应3min就能使胶原发生交联反应，形成更紧密的胶原纤维网络状结构，同时不影响单根胶原的主体构架。
　　2.电镜结果显示，GA处理再矿化2d牙本质（实验组），未GA处理矿化7d牙本质（对照组）与天然牙本质的形貌结构和矿化结晶度相似，但GA预处理后矿化时间从7d缩短至2d，由此提出戊二醛处理对牙本质仿生再矿化的促进作用。
　　3.纳米压痕检测发现:GA处理矿化2d（实验组），未GA处理矿化7d（对照组）的弹性模量和纳米硬度与天然牙本质相近。验证GA预处理是一种加快牙本质修复的潜在有效的方法。
　　4.酶解实验发现:单纯交联作用是增强酶抵抗能力的一种有效措施，但无论是GA处理矿化2d（实验组），还是未GA处理矿化7d（对照组），已矿化胶原均比单纯交联胶原抵抗酶解能力更强，从而说明矿物对胶原有力的保护作用。提示交联与矿化联合应用的可行性。
　　结论：
　　GA预处理能有效促进牙本质的仿生再矿化。拉曼光谱检测GA与胶原发生的交联反应。电镜观察发现再矿化层与天然牙本质在形貌和等级结构上的相似性。机械性能检测得出再修复的矿化层具有与天然牙本质相近的力学性能。同时，酶解实验表明矿物是保护胶原相对有效的方法。因此，利用戊二醛分子促进牙本质仿生矿化是一种潜在有效的方法，为今后牙本质快速有效的组织重建提供参考。

目录

声明

致谢

摘要

1．引言

2．材料与方法

2．1 试剂与仪器

2．2 材料与方法

2．3 表征方法

3．实验结果

3．1 拉曼光谱分析交联反应

3．2 胶原形貌变化

3．3 矿化进程

3．4 纳米机械性能

4．讨论

5．结论

参考文献

综述 纳米磷酸钙与Ⅰ型胶原在仿生矿化的研究进展

硕士期间发表论文

作者简历