潜伏相关基因UL138在人巨细胞病毒潜伏-激活中的调控及机制

摘要

人巨细胞病毒(HCMV)是目前公认的引起先天性感染最常见的病原体之一。先天性人巨细胞病毒感染会造成流产、死胎、胎儿畸形、官内发育迟缓等严重后果。HCMV侵入机体后，具有潜伏-激活的感染特性。绝大多数的HCMV母婴传播由母体潜伏病毒的激活导致，因此潜伏-激活在先天性HCMV感染中的重要性尤为突出。UL138基因是重要的HCMV潜伏相关基因。一方面，UL138基因编码的蛋白可能通过限制T细胞对感染细胞的识别，从而发挥促进病毒潜伏的作用。另一方面UL138基因编码的蛋白能促进由TNF-α信号通路介导的潜伏病毒激活的过程。因此，目前仍不清楚UL138基因在HCMV潜伏-激活中的确切角色。另外研究发现，病毒宿主细胞的分化状态对HCMV能否增殖感染起了关键性作用。迄今为止，有关UL138基因对潜伏感染细胞分化影响的研究未见报道。本研究以UL138基因作为研究对象，通过上调和下调UL138基因表达，探索UL138基因对潜伏感染状态和宿主细胞分化状态的影响，以期为UL138基因在HCMV潜伏-激活作用机制提供新思路。
　　研究目的:
　　(1)阐明潜伏相关基因UL138在HCMV潜伏-激活感染中的调控作用;
　　(2)阐明潜伏相关基因UL138是否影响宿主细胞分化状态。
　　研究方法和结果:
　　(1)构建实验室HCMV潜伏感染模型。用HCMV Towne株感染单核细胞系THP-1作为潜伏组，用HCMV Towne株感染成纤维细胞HEF作为增殖对照组。
　　①监测感染细胞内潜伏相关基因UL81-82ast的表达，确定病毒是否成功感染细胞。结果显示:潜伏相关基因UL81-82ast在增殖组和潜伏组的表达都逐渐上升。
　　②监测感染细胞内病毒DNA复制情况和增殖相关基因UL122、UL123表达情况，确定是否建立实验室HCMV潜伏感染模型。结果显示:随着感染天数增加，增殖组病毒DNA量逐渐上升，潜伏组病毒DNA量逐渐下降;增殖组中UL122和UL123基因表达都一直增加;而潜伏组中这两个基因的转录和蛋白表达呈一过性，感染后期检测不到。
　　(2)UL138基因在HCMV潜伏-激活中的调控作用
　　①构建UL138基因的慢病毒过表达载体及干扰载体，侵染单核细胞建立UL138基因过表达细胞株和UL138基因干扰细胞株。
　　②以实验室潜伏感染模型为对照，监测UL138基因过表达及干扰后感染细胞内病毒DNA水平及增殖相关基因UL122、UL123表达的变化，评价潜伏感染状态是否改变。结果显示:与对照组相比，UL138过表达后，HCMV DNA拷贝数下降，HCMV复制的关键基因UL122和UL123表达下降;UL138表达受到干扰后，HCMVDNA拷贝数上升，HCMV复制的关键基因UL122和UL123表达增加。
　　(3) UL138基因对潜伏感染细胞分化的影响。以实验室潜伏感染模型为对照，监测UL138基因过表达及干扰后染前后以下内容，从而判断UL138基因对潜伏感染细胞分化的影响。
　　①HCMV宿主细胞形态;结果显示:与对照组相比，UL138过表达后，宿主细胞伸展充分，突起明显;UL138表达受到干扰后，宿主细胞分化未见明显变化。
　　②HCMV宿主细胞表面分化抗原;结果显示:与对照组相比，UL138过表达后，宿主细胞表面分化抗原CD14表达下降;UL138表达受到干扰后，宿主细胞表面分化抗原CD45表达下降。
　　③HCMV宿主细胞分化炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和TGFβ1表达水平的变化。结果显示:与对照组相比，UL138过表达后，分化相关的炎症因子TGFβ1表达增加;UL138表达受到干扰后，分化相关的炎症因子未见明显变化。
　　结论：
　　(1) HCMV Towne株感染单核细胞THP-1后成功建立HCMV潜伏感染模型。
　　(2) UL138基因表达上调后促进或维持病毒的潜伏感染。
　　(3) UL138基因表达上调后促进宿主细胞分化。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩略词表

引言

第一部分：潜伏感染模型的建立

1．引言

2．实验材料与方法

2．1 材料

2．2 实验方法

3．实验结果

3．1 HCMV Towne株感染THP-1细胞后病毒DNA水平的变化

3．2 HCMV Towne感染后UL123和UL122转录水平变化

3．3 HCMV Towne感染后IE1、IE2蛋白水平变化

4．讨论

5．结论

第二部分：潜伏相关基因UL138对HCMV潜伏-激活状态的影响

1．引言

2．实验材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3．结果

3．1 UL138过表达载体的成功构建

3．2 UL138 shRNA干扰载体的构建

3．3 UL138多克隆抗体的制备及鉴定

3．4 UL138过表达载体成功构建

3．5 UL138干扰载体成功构建

3．6 UL138对HCMV潜伏-激活状态影响的验证

4．讨论

5．结论

第三部分：UL138基因对潜伏感染单核细胞分化的影响

1．引言

2．实验材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3．实验结果

3．1 UL138过表达或干扰后THP-1细胞形态变化

3．2 UL138过表达或干扰后THP-1细胞表面分化抗原表达的影响

3．3 UL138过表达或干扰后THP-1细胞内细胞因子表达的变化

4．讨论

5．结论

全文结论

参考文献

综述 HCMV潜伏感染机制的研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果