三氧化二砷诱导人髓性白血病Hl-60细胞自噬的分子机制

摘要

目的：以人髓性白血病HL-60细胞为研究对象，探讨三氧化二砷诱导HL-60细胞自噬的作用机制，阐明其作用分子机理。
　　方法：以人源HL-60、293T、NB4细胞为研究对象，利用不同浓度的砷剂(iAsⅢ)作用细胞后，通过Western-blot法检测其自噬相关蛋白的表达变化。其次，主要以HL-60细胞为研究对象，检测砷剂暴露后细胞内ATP变化和线粒体膜电位变化（用JC-1荧光染色）;同时，运用丙酮酸脱氢酶、乳酸、丙酮酸三种检测试剂，分别检测砷剂作用HL-60细胞后，其细胞内丙酮酸脱氢酶复合物活性和乳酸及丙酮酸的含量变化。最后，研究外源性的丙酮酸和乳酸对HL-60细胞诱导自噬影响，以Western-blot法检测其自噬相关蛋白LC3的表达变化。
　　结果：砷剂处理人源HL-60、293T、NB4三种细胞后，发现iAsⅢ引起不同细胞株的自噬发生。尤其，我们发现砷剂处理HL-60细胞6h后，砷剂对细胞能量代谢(ATP)没有明显抑制作用。用JC-1荧光染色测定线粒体膜电位变化，结果显示iAsⅢ(1、2μM)处理HL-60细胞后线粒体膜电位下降不明显，只有iAsⅢ(5μM)时略有下降。其次，利用不同浓度的iAsⅢ（1、2和5μM）作用HL-60细胞6小时后，探讨了丙酮酸脱氢酶复合体(PDHc-LA)表达变化，发现随着暴露浓度增加PDHc-LA的表达量显著下降。另外，我们进一步探讨了砷剂(2μM)作用HL-60细胞后对PDHc-LA的时效影响变化，观测到PDHc-LA的表达量随时间显著下降。同时，我们研究了砷剂对HL-60细胞的丙酮酸脱氢酶活性的影响，发现砷剂对丙酮酸脱氢酶复合物有显著抑制作用，而且我们还发现细胞内丙酮酸和乳酸含量显著升高。最后，探讨了外源性的乳酸和丙酮酸诱导HL-60细胞自噬影响，结果显示外源性的乳酸能够诱导HL-60细胞自噬发生（LC3-Ⅱ显著上调）。
　　结论：本课题拟在前期研究基础上对三氧化二砷通过抑制丙酮酸脱氢酶活性诱导细胞自噬进行更深入的研究和探讨。显示iAsⅢ可以诱导多种白血病细胞发生自噬。iAsⅢ能够抑制丙酮酸脱氢酶复合物的活性，但其产生的ATP未发生明显变化。iAsⅢ作用于HL-60细胞后，丙酮酸和乳酸含量升高。然而外源性乳酸（而不是丙酮酸）能够诱导HL-60细胞发生自噬，暗示iAsⅢ可能是介导乳酸来诱导HL-60细胞发生自噬。

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论文说明

摘要

英文缩略词表

引言

实验材料与仪器

1 实验材料

1．1 细胞株

1．2 主要试剂

2 实验仪器

实验方法

1 细胞培养

1．1 人髓性白血病细胞常规培养、冻存与复苏

1．2 贴壁细胞293T细胞的培养

2 Western Blot法检测相关蛋白表达

2．1 细胞培养、给药及样本收集

2．2 蛋白提取

2．3 蛋白浓度测定

2．4 Western Blot过程

2．5 Western Blot实验中部分试剂的配制

3 ATP的检测

3．1 样品测定的准备

3．2 标准曲线测定的准备

3．3 ATP检测工作液的配制

3．4 ATP浓度的测定

4 JC-1荧光染色评价线粒体膜电位(ΔΨm)

5 丙酮酸脱氢酶复合体的活性检测(abcam试剂盒)

6 丙酮酸含量检测(abcam试剂盒)

7 乳酸含量检测(abcam试剂盒)

8 数据统计

实验结果

1 Western-blot法检测砷剂处理多种白血病细胞后自噬相关蛋白表达变化

2 Western-blot法检测iAsⅢ作用HL-60细胞的自噬相关蛋白表达

3 iAsⅢ作用HL-60细胞发生自噬后能量代谢的变化

4 丙酮酸脱氢酶复合物的活性检测

5 iAsⅢ对于HL-60细胞线粒体膜电位的影响

6 丙酮酸和乳酸含量的检测

7 丙酮酸和乳酸对于自噬的影响

讨论

结论

参考文献

综述

作者简历及在读期间所取得的科研成果