倍他环糊精修饰的载阿霉素聚合物胶束的构建及抗肿瘤作用研究

摘要

临床上用于抗肿瘤治疗的许多药物由于溶解性能较差，毒副作用严重以及使用过程中肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药而导致其应用受到很大的限制，新型药物传递系统的开发为提高药物抗肿瘤效果提供了新的思路。本文主要研究内容是通过两亲聚合物胶束结合β-环糊精(β-CD)对疏水性药物的包合作用，构建新型药物胶束传递系统，提高对疏水性药物的包载能力，达到逆转耐药效果。β-CD拥有众多羟基，能够进行化学修饰，我们选择在其伯羟基位上链接两亲性的聚合物链，从而得到两亲性环糊精聚合物，在此基础上修饰叶酸小分子靶向基团，优化载体结构，获得具有肿瘤主动靶向能力以及具有良好耐药逆转作用的给药系统，通过对构建的胶束载药系统逆转耐药机制的深入研究，为提高抗肿瘤药物化疗效果提供新平台和新思路。本研究主要内容包括：
　　⑴以聚乙二醇单甲醚(mPEG)为亲水链，聚乳酸(PLA)或聚己内酯(PCL)为疏水链合成两嵌段共聚物，与β-CD伯羟基位相连得到基于β-CD的两亲性聚合物胶束聚乙二醇-聚乳酸-环糊精(PELA-CD)或聚乙二醇-聚己内酯-环糊精(PECL-CD)。表征合成得到的聚合物，考察其在水溶液中的胶束化行为，聚合物胶束粒径分布在100～200nm左右，CMC值在0.0016～0.01g/L之间。
　　⑵以抗肿瘤药物阿霉素为模型药物一，用乳化溶剂挥发法获得载药的聚合物胶束。比较β-CD、PEG-CD、PELA、PELA-CD胶束的载药情况，所合成的PELA-CD、PECL-CD胶束载药量普遍高于β-CD、PEG-CD、PELA，其中PELA54-CD、PECL54-CD的载药量最大，说明β-CD经聚合物修饰改性后更利于负载DOX。PLA疏水链段的加入，使得胶束结构更加稳定，与β-CD的疏水区域共同增加对疏水性阿霉素的包载。包载阿霉素后胶束的粒径主要集中在100～160nm之间，并且具有较窄的分布。载药胶束内DOX的释放具有一定的特点性，即在pH7.4的生理条件下释放缓慢，而在pH5.5的酸性条件下释放加快，有利于胶束在肿瘤部位发挥细胞毒性作用。以多烯紫杉醇为模型药物二，建立了DTX的测定方法，其精密度高，系统适应性符合要求。通过考察不同载药方法得到的胶束载药量、粒径等指标，发现薄膜水化法操作简便，易控制药物浓度，且得到的胶束包封率高、粒径在80～120 nm，透射电镜观察胶束形态，形状规整成球形。考察不同疏水链段比例的PELA-CD对载药量的影响，当亲疏水链段比例为5∶4时胶束具有最大载药量和包封率。连接β-CD之后的胶束载药量与PELA胶束相比并无明显的提高，因此，无需通过环糊精来改善两嵌段聚合物胶束对DTX的包载性能。以上结果表明构建的基于β-CD的聚合物胶束体系可广泛应用于疏水性药物的包载。
　　⑶在PEG-PLA-β-CD的基础上，引入小分子叶酸(FA)，构建同时具有主动和被动靶向作用的聚合物载阿霉素体系FA-PELA-CD/DOX。PLA疏水链段与β-环糊精的疏水区域共同增加对疏水性阿霉素的包载，叶酸修饰并未改变药物释放特性。在高表达叶酸受体的HeLa细胞上，药物摄取明显增多，对肿瘤细胞的毒性也显著增强。PEG修饰，延长了体循环时间，EPR效应增强被动靶向作用以及肿瘤部位药物滞留时间，近红外成像实验显示叶酸胶束给药10天后肿瘤部位仍具有最高的药物量。肿瘤组织切片结果显示与游离药物组相比，聚合物胶束组可以造成肿瘤细胞的不可避免的以及时间依赖性的损伤。叶酸修饰使聚合物胶束具有主动靶向作用，在增强载药胶束系统对肿瘤细胞毒性的同时能够减少对心脏的毒副作用。上述机制的共同作用最终实现了FA-PELA-CD/DOX对裸鼠KB细胞移植瘤86％的抑制效果。
　　⑷体外细胞毒性、细胞凋亡实验以及斑马鱼体内抑瘤实验发现载药胶束PELA-CD/DOX和PECL-CD/DOX可以增强DOX对MCF-7/ADR细胞的毒性。体外细胞毒性结果显示载药聚合物胶束PELA54-CD/DOX的耐药逆转倍数达到了8.82倍，PEG、PLA或PCL与β-CD的结合能够显著增强耐药逆转效果。此外载药聚合物胶束PELA54-CD/DOX对斑马鱼体内MCF-7/ADR肿瘤的抑制取得了很好的效果，高剂量组肿瘤抑制率达到64％，同时载药胶束缓解了阿霉素的心脏毒性。体外细胞对P-gp底物R123的摄取实验与斑马鱼体内罗丹明B滞留实验均表明PELA-CD和PECL-CD胶束可以提高P-gp底物在MCF-7/ADR细胞内的滞留，减少P-gp对底物的外排。通过ATP耗竭实验、ATP酶活性实验、LDH检测、细胞内活性氧和线粒体膜电位检测、细胞P-gp蛋白和MDR1基因表达检测等系列实验发现聚合物胶束逆转P-gp的作用机制为:通过耗竭细胞内ATP、减少细胞P糖蛋白的表达以及作为底物竞争性结合P-gp从而减少抗肿瘤药物的外排，最终实现耐药逆转。聚合物分子中三个组分对阿霉素的构效关系具有重要的影响。
　　⑸本研究构建了基于β-CD的聚合物胶束药物传递体系，能够提高对疏水性药物的包载能力;利用FA对胶束进行修饰，使之具有肿瘤主动靶向性，增强抑瘤效果的同时减少了DOX的毒副作用;通过相关实验总结聚合物胶束PELA-CD逆转P-gp介导的耐药机制，建立了一套较为完整的P-gp作用机制的评价体系，为后续P-gp相关的耐药逆转评价构建了平台。

目录

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致谢

摘要

缩略语

第一章 绪论

1．1 两亲性聚合物胶束在肿瘤化疗中的应用

1．2 聚合物胶束的靶向基团修饰

1．3 环糊精及其衍生物在药物制剂中应用

1．4 肿瘤多药耐药性的逆转

1．5 课题的提出(选题目的及主要研究内容)

第二章 两系列(LA，CL)环糊精聚合物的合成及表征

2．1 材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 仪器

2．2 实验方法

2．2．1 基于β-环糊精的系列聚合物聚乙二醇-聚乳酸以及聚乙二醇-聚己内酯的合成

2．2．2 聚合物的化学结构表征

2．2．3 聚合物在水中的自组装行为

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 聚合物合成及结构表征

2．3．2 聚合物在水中的自组装行为

2．4 本章小结

第三章 聚合物胶束的载药及性能评价

3．1 材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 阿霉素的包载

3．2．2 多烯紫杉醇的包载

3．3 结果与讨论

3．3．1 聚合物胶束对阿霉素的包载

3．3．2 多烯紫杉醇的包载

3．4 本章小结

第四章 叶酸修饰聚合物胶束的构建及其对药敏肿瘤的作用评价

4．1 材料与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．2 合成方法及表征

4．2．1 叶酸-聚乙二醇-聚乳酸-β-环糊精聚合物(FA-PELA-CD)的合成

4．2．2 表征

4．3 聚合物对阿霉素的包载、表征以及药物释放情况

4．3．1 叶酸修饰的两亲性聚合物胶束对阿霉素的包载及表征

4．3．2 FA-PELA-CD包载的阿霉素的释放

4．4 聚合物胶束体外细胞水平研究

4．4．1 细胞培养

4．4．2 细胞毒性实验

4．4．3 流式细胞术法检测细胞对阿霉素的摄取

4．4．4 激光共聚焦法检测细胞对阿霉素的摄取

4．5 体内药效学评价叶酸修饰的聚合物胶束对肿瘤细胞的抑制作用

4．5．1 动物模型

4．5．2 体内抗肿瘤实验

4．5．3 药物体内脏器分布实验

4．5．4 组织切片分析

4．6 结果与讨论

4．6．1 合成与表征

4．6．2 聚合物对阿霉素的包载

4．6．3 包载阿霉素的叶酸聚合物胶束释药情况

4．6．4 体外细胞毒性

4．6．5 流式细胞术法以及激光共聚焦法检测细胞对阿霉素的摄取

4．6．6 体内药效学研究

4．7 本章小结

第五章 聚合物胶束对耐药肿瘤的作用评价及机制研究

5．1 材料与仪器

5．1．1 实验试剂、材料以及细胞

5．1．2 实验仪器

5．2 实验方法

5．2．1 体外细胞毒性

5．2．2 细胞凋亡实验

5．2．3 细胞内R123积累实验

5．2．4 细胞内ATP水平检测

5．2．5 P-gP ATP酶活性检测

5．2．6 聚合物胶束对细胞表达P-gp的影响

5．2．7 RT-PCR

5．2．8 LDH含量测定

5．2．9 细胞活性氧(ROS)水平测定

5．2．10 线粒体膜电位MMP测定

5．2．11 斑马鱼体内逆转耐药研究

5．3 结果与讨论

5．3．1 载阿霉素聚合物体外细胞毒实验

5．3．2 DOX引起的细胞凋亡

5．3．3 R123在MCF-7／ADR细胞内的累积

5．3．4 ATP耗竭实验

5．3．5 聚合物对ATP酶的影响

5．3．6 聚合物对MCF-7／ADR细胞表达P-gP蛋白的影响

5．3．7 聚合物对MDR1基因的调控

5．3．8 LDH含量检测、ROS实验以及MMP检测

5．3．9 聚合物胶束逆转P-gp介导的阿霉素耐药在斑马鱼模型上的研究

5．4 本章小结

全文总结

研究创新点、不足与展望

参考文献

综述 环糊精及其衍生物的药剂学研究进展

作者简历及在读期间所取得的科研成果