核仁因子Def磷酸化修饰调控细胞周期和p53降解的研究

摘要

核仁因子Def在真核生物中保守，是核糖体小亚基加工复合体的组分，与U3snoRNA及核仁蛋白Mpp10和Sas10互作，参与核糖体RNA的加工;另外，在人和斑马鱼中，Def与分别与半胱氨酸蛋白酶CAPN3和Capn3b互作，介导p53蛋白在核仁中降解。Def作为一个如此重要的多功能蛋白，蛋白的活性需要受到精细的调控，但目前却知之甚少。
　　本课题主要着眼于Def的翻译后修饰研究，利用遗传学，细胞生物学，生物化学和分子生物学的研究方法，旨在寻找调控Def-Capn3b降解途径的翻译后修饰位点。本研究首先通过碱性磷酸酶处理蛋白样品，结合蛋白免疫印迹的方法，发现Def蛋白存在磷酸化修饰，而且其中一部分磷酸化修饰，发生在具有介导p53降解功能的Def肽段上。接着，我们利用定点突变的方法，在这一重要的肽段上，找到了5个磷酸化修饰位点，分别为S50，S58，S62，S87和S92。之后通过构建并研究磷酸化位点突变的转基因斑马鱼，发现磷酸化修饰通过调节细胞周期从G1到S以及G2到M的进程，调节斑马鱼肝脏发育。更为重要的是，研究也发现磷酸化修饰是Def在核仁中介导p53降解所必需。本研究的成果，为Def-Capn3蛋白降解途径的信号通路研究，奠定了坚实的基础。
　　此外，本研究还发现DefN端具有的酸性氨基酸（E和D）富集的特性，导致其在SDS-PAGE上的分子量，比其理论分子量大13 kDa。通过分析Def来源的13个蛋白片段迁移速率与不同类型氨基酸比例之间的关系，我们发现蛋白分子量的差异与酸性氨基酸的比例，呈线性正相关:y=276.5x-31.33(x代表酸性氨基酸的比例，y代表每个氨基酸的平均ΔMW)。并且该方程成功地预测了其它13个酸性蛋白在SDS-PAGE上的分子量。该方程的建立，成功地解决了酸性氨基酸影响蛋白迁移速率这一问题。
　　综上所述，论文以解析Def-Capn3b蛋白降解途径为研究目的，着重开展Def蛋白的生化功能研究，发现Def磷酸化修饰调控细胞周期和p53降解，以及酸性氨基酸影响蛋白迁移速率的特性并建立了计算方程。

目录

声明

摘要

List of Abbreviations缩略词

1 绪论

1．1 核仁

1．1．1 核仁的结构

1．1．2 核仁的组装和解体

1．1．3 核仁：核糖体合成的工厂

1．1．4 核仁：不仅是核糖体合成的工厂

1．2 斑马鱼作为模式生物的优势

1．4．1 斑马鱼作为模式生物的历程

1．4．2 斑马鱼作为模式生物的优势

1．4．3 斑马鱼在研究肝脏发育和再生过程中的优势

1．3 斑马鱼肝脏发育

1．4．1 斑马鱼肝脏的形态发生

1．4．2 影响斑马鱼肝脏发育的中胚层信号因子

1．4．3 肝脏发育过程中的其它调控基因

1．4 def基因及其生物学功能

1．4．1 斑马鱼旋def基因

1．4．2 斑马鱼defhi429突变体的形态分析

1．4．3 Def在rRNA加工过程中的作用

1．4．4 Def在p53降解过程中的作用

1．5 本研究的目的、内容和意义

2 实验材料和方法

2．1 斑马鱼实验总述

2．1．1 斑马鱼伦理

2．1．2 斑马鱼数据库与参考资料

2．1．3 斑马鱼的饲养与繁殖

2．1．4 斑马鱼品系

2．1．5 斑马鱼胚胎显微注射(microinjection)

2．2 人类细胞系

2．2．1 细胞培养与传代

2．2．2 细胞冻存与复苏

2．2．3 脂质体转染

2．3 常用溶液及培养基

2．4 DNA相关实验方法

2．4．1 DNA提取

2．4．2 聚合酶链式反应(PCR)

2．4．3 DNA纯化

2．4．5 大肠杆菌操作

2．4．6 DNA测序

2．4．7 细胞凋亡检测

2．4．8 EdU掺入实验

2．5 RNA相关实验方法

2．5．1 斑马鱼胚胎总RNA提取

2．5．2 Dnasel消化RNA中残留的DNA

2．5．3 RNA逆转录

2．5．4 mRNA体外转录

2．5．5 Morpholinos

2．5．6 斑马鱼胚胎整胚原位杂交(WISH)

2．6 蛋白相关实验方法

2．6．1 蛋白免疫印迹(Western Blot)

2．6．2 蛋白SDS-PAGE分子量计算

2．6．3 糖苷酶处理

2．6．4 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(CIP)处理

2．6．5 免疫荧光染色

2．7 转基因鱼的制备

2．8 载体及引物信患列表

3 DefS50，S58，S62，S87和S92为磷酸化修饰位点

3．1 Def蛋白存在磷酸化修饰

3．1．1 内源Def蛋白存在磷酸化修饰

3．1．2 Def蛋白的2-189片段和190-377片段均存在磷酸化修饰

3．1．3 Def蛋白的2-189片段中2-95肽段存在磷酸化修饰

3．2 DefS50，S58，S62，S87和S92为磷酸化修饰位点

3．2．1 DefS50位点突变为A后导致较明显位移

3．2．2 DefS58和S62位点突变为A产生较明显位移

3．2．3 DefS50，S58，S62，S87和S92为磷酸化修饰位点

4 Def磷酸化修饰调控斑马鱼肝脏发育

4．1 mRNA拯救实验筛选影响斑马鱼肝脏发育的磷酸化修饰位点

4．2 表达磷酸化位点突变Def转基因斑马鱼的构建

4．2．1 转基因斑马鱼的构建

4．2．2 转基因斑马鱼中过表达的mRNA均位于肝脏区域

4．2．3 Def及其磷酸化位点突变蛋白均定位于核仁

4．3 Def磷酸化修饰调控斑马鱼肝脏发育

4．3．1 Def磷酸化修饰为肝脏发育所必需

4．3．2 肝脏体积计算结果显示Def磷酸化修饰为肝脏发育所必需

5 Def磷酸化修饰调控细胞周期和p53降解

5．1 def/-Tg(LF：S58,62A)和def/-Tg(LF：S87,92A)肝脏发育缺陷并非由于细胞凋亡引起

5．2 Def磷酸化修饰调控细胞周期

5．2．1 DefS58和S62的磷酸化修饰调控细胞周期

5．2．2 DefS87和S92的磷酸化修饰调控细胞周期

5．3 Def磷酸化修饰调控核仁中p53的降解

5．3．1 Def在核仁中介导p53降解

5．3．2 Def磷酸化修饰调控核仁中p53的降解

6 酸性蛋白在SDS-PAGE上的分子量同其理论分子量的差异与酸性氨基酸比例呈线性关系

6．1 Def在SDS-PAGE上的分子量比氨基酸序列预测的理论分子量大～13kDa

6．2 Def蛋白的迁移特性并非由于氨基酸序列错误引起

6．3 Def N端导致其在SDS-PAGE上的分子量比理论分子量大～13kDa

6．4 Def蛋白的迁移特性并不主要由蛋白翻译后修饰引起

6．3．1 DefN端没有糖基化修饰

6．3．2 DefN端没有发生(类)泛素化修饰

6．3．3 Def片段D16和D17分担了D15的迁移特性

6．5 DefN端酸性氨基酸富集的特性引起迁移速率变慢

6．5．1 DefN端拥有高比例的酸性氨基酸E和D

6．5．2 △MW与酸性氨基酸的含量呈线性正相关

6．6 方程成功地预测酸性蛋白Sas10，Mpp10和Bmsll在SDS-PAGE上的大小

6．7 方程成功地预测来自引用文献的酸性蛋白在SDS-PAGE上的大小

7 讨论和结论

7．1 讨论一：Def磷酸化修饰

7．2 讨论二： Fibrillarin是Def-Capn3核仁降解途径的另一个底物?

7．3 讨论三：酸性氨基酸影响蛋白迁移速率方程的构建

7．4 结论

参考文献

作者简介

致谢