蜜蜂囊状幼虫病病毒的种间交叉感染研究及其生物信息学分析

摘要

养蜂业除生产蜂产品外，对于提高农作物产量、维护生态平衡也有重要意义。蜜蜂属下有9个种，目前仅西方蜜蜂（Apis mellifera）和东方蜜蜂(A.cerana)被人工大量的饲养。蜜蜂囊状幼虫病是由囊状幼虫病病毒（Sacbrood Virus，SBV）引起的一种蜜蜂幼虫病毒性疾病，该病是东方蜜蜂的首要病害，但对西方蜜蜂却不会造成明显危害。前人根据实验室和蜂群条件下病毒对幼虫的致病力得出结论认为感染东方蜜蜂的SBV(AcSBV)病毒和西方蜜蜂的SBV（AmSBV）病毒不能发生种间交叉感染，然而近年来有研究根据两种蜜蜂种来源的SBV毒株的序列比对和进化分析推测二者可以发生种间交叉感染。为了阐明SBV病毒在东方蜜蜂和西方蜜蜂间是否有宿主特异性及分析其在不同蜂种引起致病力差异的可能原因，本课题以西方蜜蜂种下的意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，简称意蜂）、东方蜜蜂指名亚种中华蜜蜂(Apis cerana cerana，简称中蜂)和SBV病毒为对象进行了研究。
　　研究内容和结果主要包括:(1)调查了来自不同健康状态蜂群的318份意蜂群样本和64份中蜂群样本的SBV感染情况，并测序分析其基因型。源于表面健康蜂群的蜜蜂样本检测结果显示中蜂群的SBV感染率(28.95％)显著高于意蜂群的感染率(10.39％，p=0.003);源于弱群及病群的蜜蜂样本检测结果显示中蜂群100％的SBV感染率显著高于意蜂群23.08％的感染率(P＜0.001)。表明与西方蜜蜂相比，东方蜜蜂更易遭受SBV病毒的感染。通过MEGA6.0软件构建的进化树显示，本研究中分离自中蜂的SBV毒株和NCBI数据库中其他东方蜜蜂SBV毒株聚类为一个分支，绝大多数分离自意蜂的SBV毒株与数据库中分离自意蜂的SBV毒株聚类为一个分支。但是，两株分离自意蜂的SBV病毒与分离自东方蜜蜂的SBV毒株聚在同一分枝，暗示AcSBV病毒和AmSBV病毒可以在蜜蜂种间发生交叉感染。(2)分别在实验室和蜂群条件下给意蜂接种中蜂囊状幼虫病病毒(AccSBV)，研究病毒致病性和复制情况。结果显示，实验室条件下，在对中蜂幼虫已产生高致死率的浓度条件下(P＜0.05)，AccSBV病毒对意蜂幼虫和成年工蜂的致死率与PBS对照组相比无显著差异(P＞O.05)，但是Tagged RT-PCR检测意蜂幼虫和成年工蜂体内AccSBV病毒的负义链呈阳性。蜂群条件下的接种实验也验证了这一结果。同时RT-qPCR显示，在实验室条件下AccSBV病毒接种到中蜂和意蜂成年工蜂后都能够快速地增殖，并且有相似的增殖规律，都在接种后第6天到达平台期。这些结果表明AccSBV病毒能够感染意蜂，但在对两种蜜蜂的致病性上存在显著差异。(3)研究了东方蜜蜂囊状幼虫病病毒和西方蜜蜂囊状幼虫病病毒的遗传进化关系。采用MEGA6.0软件对NCBI数据库中现有的20个AcSBV和5个AmSBV基因组以及推导氨基酸序列进行比对。核苷酸序列比对显示，在8585个碱基位点中，AcSBV与AmSBV之间有55.4％的保守碱基位点(4756/8585)，44.6％的突变或缺失位点(3829/8585)。基因组推导氨基酸序列比对结果显示，在2860个氨基酸位点中，AcSBV与AmSBV之间有80.0％保守的氨基酸位点(2287/2860)，20％存在突变的氨基酸位点(573/2860)。相对于AmSBV，AcSBV有9个特异并保守的氨基酸，同时相对于AcSBV，AmSBV也有9个与之对应特异并保守的氨基酸。这些结果暗示这些关键的氨基酸位点差异可能是AcSBV与AmSBV病毒引起不同蜂种危害程度差异的原因（之一）。
　　综上所述，本课题研究取得了与之前大多数研究不同的结果，明确了东方蜜蜂囊状幼虫病病毒能够感染西方蜜蜂;同时，通过序列比对找出了东方蜜蜂囊状幼虫病病毒和西方蜜蜂囊状幼虫病病毒间的有特异性的氨基酸差异位点，为SBV病毒的侵染机制研究和防治东方蜜蜂囊状幼虫病奠定了一定的基础。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 蜜蜂资源简介

1．2 蜜蜂病毒性疾病

1．3 蜜蜂囊状幼虫病病毒(SBV)的研究进展

1．3．1 SBV病毒的分子生物学特征

1．3．2 SBV病毒的遗传进化关系

1．4 病毒的定量方法

1．5 病毒负义链的检测

1．6 研究意义及主要研究内容

1．6．1 研究意义

1．6．2 主要研究内容

1．6．3 研究技术路线

第2章 中、意蜂蜂群SBV病毒的检测及其遗传进化关系研究

2．1 实验材料与方法

2．1．1 主要试剂及仪器

2．1．2 样品的采集

2．1．3 RNA提取

2．1．4 逆转录反应

2．1．5 RT-PCR检测SBV病毒

2．1．6 琼脂糖电泳

2．1．7 数据分析

2．1．8 构建进化树

2．2 实验结果

2．2．1 中、意蜂蜂群SBV病毒的感染率

2．2．2 SBV病毒的遗传进化分析

2．3 讨论

2．4 小结

第3章 中蜂SBV病毒感染意蜂的实验研究

3．1 实验材料与方法

3．1．1 主要试剂及仪器

3．1．2 中、意蜂健康蜂群的筛选

3．1．3 中蜂SBV病毒液的准备

3．1．4 接种用的中蜂SBV病毒的定量

3．1．5 蜜蜂幼虫饲料的配制方法

3．1．6 接种实验

3．1．7 RT-PCR检测实验样本的SBV病毒

3．1．8 相对定量法分析SBV病毒在蜜蜂成年工蜂体内的增殖情况

3．1．9 意蜂体内中蜂SBV病毒负义链的检测

3．1．10 统计分析

3．2 结果

3．2．1 实验室条件下幼虫接种中蜂SBV后幼虫的感染和死亡情况

3．2．2 实验室条件下成年工蜂接种中蜂SBV病毒后的存活率

3．2．3 中蜂SBV病毒在实验室条件下成年工蜂体内的增殖情况

3．2．4 蜂群条件下中蜂SBV病毒接种意蜂的实验结果

3．2．5 意蜂体内中蜂SBV病毒的负义链检测

3．3 讨论

3．4 小结

第4章 东方蜜蜂SBV病毒和西方蜜蜂SBV病毒的遗传进化分析

4．1 材料与方法

4．1．1 用于进化分析的SBV毒株

4．1．2 基因组数据分析

4．2 结果

4．2．1 东方蜜蜂、西方蜜蜂SBV病毒核苷酸序列比对

4．2．2 东方蜜蜂、西方蜜蜂SBV病毒基因组推导氨基酸序列比对

4．2．3 蜜蜂SBV病毒基因组的进化分析

4．3 讨论

4．4 小结

第5章 全文总结、创新点和研究展望

5．1 主要结论

5．2 创新点

5．3 不足之处及研究展望

参考文献

硕士期间发表的论文

国际交流及会议

致谢