柔嫩艾美耳球虫甘露醇合成相关酶M1PDH和M1Pase的生物学特性与酶动力学研究

摘要

鸡球虫病是当今家禽产业中普遍存在的疾病，主要是由胞内寄生虫艾美耳球虫引起的，每年都会给养禽业造成很大的损失。完善对艾美耳球虫的代谢过程的研究，可以为球虫病的防控提供更多参考。甘露醇循环不仅提高了糖代谢能量的利用率，还保证了球虫在非寄生阶段所需的能量供给，且甘露醇的合成与代谢在高等真核生物中是没有的，所以球虫甘露醇循环相关酶可以成为较好的药物靶标。已有的研究表明艾美耳球虫的甘露醇代谢合成酶M1PDH和M1Pase可能具有很高的催化活性，探明这两种酶的生物学与酶动力学特性不仅可以为后续抗球虫药的开发提供参考，同时也为发展新的甘露醇合成技术打好基础。
　　本研究根据GenBank上已公布的柔嫩艾美耳球虫（Eimeiria tenella）甘露醇-1-磷酸脱氢酶(m1pdh)和甘露醇-1-磷酸酶(m1pase)的序列设计引物，以浙江株未孢子化艾美耳球虫卵囊cDNA为模板扩增得到目的片段，构建原核表达体系表达重组蛋白。经在线软件预测与分析，发现扩增得到的m1pdh与已公布的序列有7个碱基、5个氨基酸序列发生突变，预测该蛋白有6个跨膜螺旋区域但无跨膜拓扑结构，二级结构形成较多α螺旋和10个二硫键，其预测的蛋白三级结构与弗氏志贺菌（Shigella flexneri）甘露醇-1-磷酸-5-脱氢酶(M1PDH5)三级晶体结构有21.38％的同源性;浙江株E.tenella的m1pase基因与已公布的序列有2个碱基、1个氨基酸突变，经预测该蛋白有有一个分值很高的跨膜拓扑结构，其N-端很有可能位于膜外，也形成较多α螺旋二级结构和7个二硫键，为组氨酸磷酸酶家族成员之一，其预测的蛋白三级结构与酿酒酵母(S.cerevisiae)磷酸甘油酸酯转移酶-1(PM1)晶体结构有23.35％的同源性。
　　利用已获得的重组蛋白分别制备抗BL21-pET30a-M1PDH和抗BL21-pET30a-M1Pase的多克隆抗体，并对M1PDH和M1Pase在球虫各生活史阶段亚细胞定位进行研究。定位结果表明，M1PDH和M1Pase在裂殖子、裂殖体、配子体和子孢子中均有表达，在裂殖体和配子体中M1PDH与M1Pase蛋白表达于细胞所有部位，无特定聚集部位;在裂殖子和子孢子中M1PDH与M1Pase蛋白表达于除细胞核所在区域的细胞质中。
　　为探究E.tenella的M1PDH和M1Pase两酶在甘露醇合成过程中所起到的催化作用，本研究设计了以重组可融性蛋白代替天然蛋白，在体外进行酶动力学研究实验。结果表明，NADPH和NADH均可作为重组蛋白BL21-pET30a-M1PDH酶反应的底物，该蛋白的最佳反应温度为37℃，在以NADH为底物时M1PDH的Km值为199.05μM，Vmax为30.67μM/min;在以NADPH为底物时M1PDH的Km值为1772.10μM，Vmax为476.19μM/min;而重组蛋白BL21-pET30a-M1Pase的最佳反应温度为35℃，Km值为818.90μM，Vmax为91.74μM/min。与其他物种相同作用的酶相比较，艾美耳球虫的甘露醇合成相关酶M1PDH和M1Pase具有较高的底物亲和性和催化活性。
　　综上所述，本研究成功克隆表达了M1PDH和M1Pase蛋白，并制备了相应的多克隆抗体，成功定位了这两种蛋白在裂殖子、裂殖体、配子体、子孢子的表达位置，且酶动力学研究表明这两种酶具有较高的底物亲和性和催化活性。本研究进一步证明了甘露醇循环与E.tenella完成生活史相关，且M1PDH和M1Pase的体外酶动力学研究结果也为后续开发抗球虫药和发展新的甘露醇合成技术提供参考。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 文献综述

第一章 鸡球虫病及其防控

1 鸡球虫病现状

2 鸡球虫病的防控

3 小结

第二章 艾美耳球虫的甘露醇循环

1 球虫的甘露醇循环

2 甘露醇代谢对球虫发育的意义

3 球虫甘露醇合成酶研究进展

4 小结

第二部分 研究内容

第三章 柔嫩艾美耳球虫m1pdh与m1pase基因克隆与表达

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第四章 M1PDH和M1Pase在球虫各阶段亚细胞定位研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第五章 M1PDH和M1Pase酶动力学研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

结论

附录

攻读硕士学位期间的主要成果

参考文献

致谢