农杆菌活体转化技术的优化与高抗草甘膦棉种质的创制

摘要

棉花是唯一可由种子生产纤维的农作物，棉花生产需要投入较多劳动力。由于劳动力的转移，我国的人工价格不断上涨，植棉的比较效益和经济效益下降，导致近年我国棉花生产的连年滑坡。我国的棉花生产仍以人工作业为主，其中棉田除草是植棉用工的主要内容之一，占植棉用工的1/3以上。草甘膦(Glyphosate)是一种典型的广谱性、内吸传导型灭生性除草剂，是杂草控制的首选除草剂。本研究将具有自主知识产权的抗草甘膦除草剂基因(EPSPS-G6)构建进植物表达载体，用农杆菌活体转化方法将目的基因转入陆地棉推广品种中棉所49，创制高抗草甘膦棉花种质系，分析其抗性表现及相关农艺性状，探讨其生产应用前景。主要研究结果如下:
　　1、利用本实验室构建的表达载体pCAMBIA1300-EPSPS-G6，酶切获得目的基因EPSPS-G6，并与空载体pCAMBIA2301连接构建棉花高效表达载体——pCAMBIA2301-EPSPS-G6，去除原载体中的NPII筛选标记基因，将目的基因作为筛选标记。
　　2、对本实验室创制的农杆菌活体转化方法进行优化。结果表明，含50mg/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)的转化液可将阳性率提高至22.18％，是对照(9.72％)的2.28倍。此外，不同转化时间转化效率差异显著，其中开花当天中午12:00～14:00转化得到阳性率最高(22.18％)，下午13:00～15:00次之(18.86％)，上午8:00～10:00转化效率最低(11.29％)。
　　3、采用优化的农杆菌活体转化方法，将EPSPS-G6基因导入到陆地棉推广品种——中棉所49，共收获转化种子14.3 kg，T0转化植株经20 mM草甘膦喷施，阳性率达22.18％。经PCR验证，共获得了35株含EPSPS-G6基且抗草甘膦的T0转基因植株。
　　4、T1转基因后代的抗性分离比例从1/4～3/4不等。对T1阳性植株进行自交，按单株收获，T2抗性稳定材料占19.8～32.1％，基本符合一对杂合基因分离的规律。
　　5、田间草甘膦抗性水平和莽草酸含量结果表明，转EPSPS-G6基因棉花种质系可抗3倍以上的推荐浓度，其抗性水平明显优于美国抗草甘膦品种和本实验室创制的第一代抗草甘膦棉花种质系，其中EPSPSG6-501种质系抗草甘膦的能力最强。
　　6、转EPSPS-G6基因棉花种质系籽棉产量、皮棉产量、衣分均与中棉所49近似;铃重、籽指略高于对照;株高与对照近似;果枝数略低于对照;单株铃数与对照一致。纤维品质检测结果表明，转EPSPS-G6基因棉花种质系的纤维长度和整齐度略优于对照;马克隆值与对照在同一品级且略好于对照;伸长率略低于对照;断裂比强度与对照相同。说明外源基因对于转基因棉花种质系的产量、农艺性状和纤维品质无明显影响。
　　7、调查了金华地区的杂草发生情况与防控成本，为抗草甘膦棉花品种的应用提供依据。结果表明，金华地区棉田杂草以牛筋草、马齿苋和小飞蓬为主，化学除草可节省植棉除草用工开支约1000元/亩，抗草甘膦棉花品种的生产应用可取得显著的经济效益，具有广阔的生产应用前景。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 棉花遗传转化研究进展

1．2 常见的棉花遗传转化技术

1．2．1 基因枪法

1．2．2 花粉管通道法

1．2．3 农杆菌介导法

1．3 抗草甘膦基因工程研究进展

1．3．1 草甘膦简介

1．3．2 草甘膦作用机理

1．3．3 抗草甘膦棉花新品种选育

1．4 抗除草剂转基因棉花推广种植情况

1．5 本研究的目的意义

第二章 高抗草甘膦表达载体的构建

2．1 材料和试剂

2．1．1 菌株与质粒载体

2．1．2 培养基及试剂

2．1．3 主要试剂(盒)、酶

2．1．4 仪器

2．2 试验方法

2．2．1 设计引物与活化验证试验的菌株

2．2．2 大肠杆菌质粒DNA的抽提

2．2．3 大肠杆菌感受态制备及热击转化

2．2．4 质粒载体的改造

2．2．5 农杆菌电击感受态的制备及电击

2．3 结果与分析

2．3．1 菌株鉴定

2．3．2 重组质粒酶切验证

2．3．3 重组质粒PCR验证EPSPS-G6目的基因

2．3．4 转化后农杆菌菌株的验证

2．4 讨论

第三章 农杆菌活体转化法的优化与高抗草甘膦棉花新种质创制

3．1 材料与方法

3．1．1 材料与试剂、设备

3．1．2 方法与操作

3．2 转化后代的筛选

3．2．1 不同转化方法的转化效率

3．2．2 草甘膦筛选植株PCR检测

3．3 抗性棉花品系的分子学检测及农艺性状测定

3．3．1 抗草甘膦棉系的分子特征鉴定

3．3．2 莽草酸含量测定

3．3．3 转基因棉系抗性分析

3．3．4 转基因棉系农艺性状等测定

3．4 结果与分析

3．4．1 转基因抗草甘膦棉花种质系的创制

3．4．2 不同转化条件效果对比

3．4．3 转EPSPS-G6基因棉花种质系的抗性表现

3．4．4 转EPSPS-G6基因棉花种质系的基因表达情况

3．4．5 转EPSPS-G6基因棉花种质系的农艺性状与纤维品质

3．5 讨论

第四章 高抗草甘膦棉花新种质生产应用前景

4．1 金华市棉花生产基本状况

4．2 金华市植棉技术转变及棉田杂草调研

4．2．1 金华市植棉方式转变

4．2．2 棉田主要杂草

4．3 除草成本调研

4．4 棉田喷施草甘膦的药害情况

4．5 高抗草甘膦棉花新品种应用前景

4．5．1 高抗草甘膦棉花新种质

4．5．2 应用抗草甘膦棉花品种的限制因素

4．5．3 高抗草甘膦棉花品种的应用前景

全文小结

参考文献