填埋场覆盖土及甲烷氧化菌氧化CH4过程中的胞外多聚物形成及影响因子研究

摘要

在填埋场覆盖土层CH4氧化过程中，胞外多聚物(extracellular polymericsubstances，EPS)的累积会对CH4氧化产生抑制作用。EPS是微生物分泌到细胞外的大分子有机物，其生成受到多种环境因子的调控。对此，本研究以垃圾生物覆盖土(waste biocover soil，WBS)和甲烷氧化菌Methylosinus sporium为材料，研究了CH4氧化过程中EPS的生成及其影响因子，分析了CH4和O2浓度对覆盖土的CH4活性、EPS的生成及甲烷氧化菌种群结构的影响，探究了溶解型EPS(soluble EPS，S-EPS)、疏松附着性EPS(loosely bound EPS，LB-EPS)和紧密附着型EPS(tightly bound EPS，TB-EPS)与CH4氧化活性的关系，以及环境因子对甲烷氧化菌的活性、EPS的生成和CH4-C分配的影响。为有效控制CH4氧化过程中EPS的形成，维持填埋场覆盖土层持续高效的CH4氧化能力，减少填埋场CH4排放提供理论依据。主要结论如下：
　　(1)随着暴露CH4时间的增长，WBS的CH4氧化活性呈先升高后降低的趋势。当CH4达到饱和浓度(10％)后，继续增大CH4浓度对WBS的CH4氧化活性无显著影响。当CH4浓度相同时，增大O2浓度在前期能有效地促进CH4氧化，但在后期较高的O2浓度(5％～21％)对CH4氧化活性无促进作用，相反，由于EPS的累积，过高的O2浓度会在一定程度上抑制CH4氧化。
　　(2)在WBS的CH4氧化过程中，增大O2浓度会促进EPS的生成，包括胞外蛋白(extracellular protein，ECP)和胞外多糖(extracellular polysaccharide，ECPS)的生成。在充足的CH4条件下(≥10％)，CH4浓度对WBS中EPS的生成无显著影响;当CH4不足时则会促进WBS中ECP的生成。
　　(3) WBS中优势甲烷氧化菌为Ⅰ型甲烷氧化菌Methylocaldum、Methylococcaceae、Methylomicrobium、Methylobacter和Ⅱ型甲烷氧化菌Methylosinus。随着暴露CH4和O2浓度的不同，WBS中甲烷氧化菌种群结构呈现出不同的变化。当O2浓度≥5％时Methylocaldum占优势;在缺氧条件下Methylomicrobium占优势;在O2浓度为21％和CH4浓度为10％～50％时Methylosinus有较高的丰度。实验分析的环境因子对甲烷氧化菌种群结构影响的重要性依次为:ECPS＞O2＞EPS＞CH4＞ECP，其中ECPS和O2浓度对甲烷氧化菌种群结构有显著的影响。
　　(4)在Methylosinus sporium的CH4氧化过程中EPS的累积对其活性具有反馈抑制作用。在连续培养过程中TB-ECPS和LB-ECP的含量与CH4氧化活性呈显著的负相关关系;向Methylosinus sporium中添加EPS，其CH4氧化活性随着EPS添加量的增大而降低，且EPS及其主要成分S-ECP、S-ECP、LB-ECP、S-ECPS、S-ECPS和LB-ECPS对CH4氧化活性的影响均符合指数函数。
　　(5) Methylosinus sporium的EPS形成受到多种环境因子的影响。当CH4浓度为10％～15％、O2浓度为10％、NO3--N为20～140mg L-1、pH6.5～7.5、温度为30～40℃和Cu2+浓度≤20μmol L-1时，细胞具有较高的生长速率和CH4氧化活性，EPS分泌量少，有利于CH4氧化的持续高效进行。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

1．1 生活垃圾填埋场CH4的排放

1．2 填埋场覆盖土层的CH4作用

1．3 甲烷氧化菌EPS的形成特性及其对CH4氧化活性的影响

1．3．1 微生物EPS的特性与功能

1．3．2 甲烷氧化菌EPS的形成特性

1．3．3 EPS对CH4氧化活性的影n向

1．4 微生物EPS形成的影响因子

1．4．1 营养条件

1．4．2 O2浓度

1．4．3 pH

1．4．4 温度

1．5 研究目的及意义

2 填埋场覆盖土层CH4氧化过程中EPS的形成及其对CH4和O2浓度的响应

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 填埋场覆盖土微生态实验

2．1．3 CH4氧化活性测定

2．1．4 EPS的提取与测定

2．1．5 DNA提取和PCR扩增

2．1．6 T-RFLP分析

2．1．7 克隆文库和系统发育树构建

2．1．8 统计分析

2．2 结果与讨论

2．2．1 CH4和O2浓度对CH4氧化活性的影响

2．2．2 CH4和O2浓度对EPS含量的影响

2．2．3 EPS含量的模型预测

2．2．4 甲烷氧化菌的种群结构

2．2．5 O2和CH4浓度对甲烷氧化菌种群结构的影响

2．2．6 环境因子对甲烷氧化菌种群结构的影响

2．3 本章小结

3 EPS对甲烷氧化菌活性的影响

3．1 材料和方法

3．1．1 实验菌株和培养基组成

3．1．2 甲烷氧化菌的培养和生长量测定

3．1．3 CH4氧化活性测定

3．1．4 甲烷氧化菌EPS的提取与测定

3．1．5 EPS添加对甲烷氧化菌活性的影响

3．2 结果与讨论

3．2．1 细胞的生长与CH4氧化活性

3．2．2 EPS含量

3．2．3 EPS含量与CH4氧化活性的关系

3．2．4 Methylosinus sporium EPS含量对其添加的响应

3．2．5 Methylosinus sporium活性对EPS添加的响应

3．3 本章小结

4 环境因子对甲烷氧化菌EPS生成的影响

4．1 材料和方法

4．1．1 实验材料和培养基组成

4．1．2 环境因子对甲烷氧化菌EPS形成的影响

4．1．3 分析方法

4．1．4 CH4-C的分配计算

4．2 结果与讨论

4．2．1 CH4浓度的影响

4．2．3 O2浓度的影响

4．2．2 氮源的影响

4．2．4 pH的影响

4．2．5 温度的影响

4．2．6 Cu2+的影响

4．3 本章小结

5 结论与展望

5．1 主要结论

5．2 展望

参考文献

攻读硕士期间研究成果与个人荣誉