马兜铃酸-Ⅰ诱导犬肝肿瘤干/祖细胞样细胞发生过程中cfa-let-7b microRNA簇和cfa-miR-23a簇预测与相关靶蛋白确证研究

摘要

目的:研究并预测AAI致比格犬肝脏形成肿瘤干/祖细胞样细胞过程中，表达发生改变的相关microRNAs(miRNAs)及miRNAs簇，并对miRNA簇转录后相关靶蛋白进行验证。
　　方法:(1)健康成年比格犬8只，雌雄各半，口服AAI胶囊(3 mg/kg/day)，对照组给予等量空胶囊，连续给药10天，于停药2天后，戊巴比妥钠麻醉处死。取8个肝脏样品（对照组C1、 C2、C3、 C4;实验组A1、A2、A3、 A4），经miRNA芯片分析miRNAs差异表达谱。在上述发现的差异表达miRNAs的基础上，通过生物信息学软件进一步进行邻近miRNAs的预测，以获取基于miRNA簇的肝脏肿瘤干/祖细胞样细胞形成的转录后生物信息学调控网络。通过对miRBase数据库（http://mirbase.org/）的检索，找出所有跨度小于40 kb的miRNAs，以与miRNA芯片结果进行比较，除了簇中表达发生变化的miRNAs，其他邻近的miRNAs也经挑选进行qRT-PCR验证，验证结果使用不配对Mann Whitney检验法进行统计分析，P＜0.05代表差异显著。(2)采用TargetScan（www.targetscan.org）和miRDB（www.mirdb.org）数据库预测不同miRNAs的靶基因，两种软件预测结果相互交叉的部分导入DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov），以分析其可能影响的KEGG代谢通路（www.genome.jp/kegg），代谢通路的预测结果由Fisher精确检验进行统计分析，最后对落在代谢通路中的靶基因数目和该代谢通路中已知的基因数目进行检验。(3)通过Western blot检测肝组织中cfa-miR-23a簇成员miR-27a靶点FOXO1的表达情况。(4)通过免疫组织化学检测肝组织中磷酸化叉头蛋白(Phosphorylationp forkhead box protein1，p-FOXO1)的形态学分布情况，以阐明AAI诱导形成肝肿瘤干/组细胞样细胞的可能病理机制。
　　结果:(1)AAI连续给药10天后取肝组织经miRNAs芯片分析及qRT-PCR验证发现，AAI组（实验组）与CON组（对照组）相比，cfa-miR-378，cfa-let-7b，cfa-miR-33a表达下调，cfa-miR-200c，cfa-miR-24，cfa-miR-660表达上调（上调倍率＞1.6，下调倍率＞1.7，P＜0.05），基于上述差异表达的miRNAs进行邻近miRNAs的qRT-PCR验证，从miRBase数据库得出cfa-let-7a-1～let-7b和cfa-miR-23a～27a～24-2这两组miRNA簇分别出现表达一致变化，其中cfa-miR-23a～27a～24-2表达上调，cfa-let-7a-1～let-7b表达下调。(2)预测发现上述miRNA簇与细胞凋亡、免疫信号转导等生物学过程相关，其中MAPK信号通路受miR-27a潜在调控，提示AAI致肝脏损伤后，cfa-let-7b簇及cfa-miR-23a簇参与细胞凋亡、免疫信号转导等重要途径。(3)Western blot结果显示，与CON组相比，AAI组cfa-miR-23a簇成员miR-27a靶蛋白F OXO1在胞核中表达下调，p-FOXO1在胞浆中显著上调(P＜0.05)，提示簇成员miR-27a激活FOXO1蛋白磷酸化进入胞浆。(4)免疫组织化学结果显示，对照组p-FOXO1阳染区仅存在于胞核中，而实验组p-FOXO1与对照组相比位于胞浆的阳染区显著加深，而部分细胞胞核的阳染区变浅，提示miR-27a靶向FOXO1磷酸化激活使部分表达于细胞核内的p-FOXO1溢出至胞浆，使细胞“逃逸”凋亡，维持癌前病变状态。
　　结论:AAI致比格犬肝脏损伤后cfa-let-7a-1～let-7b簇和cfa-miR-23a～27a～24-2簇参与细胞凋亡、免疫信号转导的重要途径，其中cfa-miR-23a簇成员miR-27a通过调控下游靶基因FOXO1/p-FOXO1介导MAPK信号通路，使部分细胞FOXO1磷酸化激活“逃逸”凋亡，并维持肝脏干细胞样特征，最终发展成肿瘤干/祖细胞样细胞。

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摘要

论文创新点

英文缩略词表

AAI诱导比格犬肝肿瘤干／祖细胞样细胞发生相关cfa-let-7b microRNA簇和cfa-miR-23a簇预测分析

引言

1．1 实验材料与动物

1．1．1 主要实验材料

1．1．2 实验动物

1．2 实验方法

1．2．1 动物分组及药物处理

1．2．2 miRNA芯片分析及qRT-PCR验证

1．2．3 基于miRNAs差异表达谱预测miRNA簇

1．2．4 数据统计

1．3 实验结果与分析

1．3．1 AAI致比格犬肝脏炎症损伤中差异表达的miRNA芯片分析

1．3．2 AAI致比格犬肝脏炎症损伤中差异表达的miRNA簇的预测

1．3．3 代谢通路分析

1．4 讨论

1．5 小结

AAI致比格犬肝脏炎症损伤中cfa-miR-23a簇成员miR-27a调控靶蛋白的验证

引言

2．1 实验仪器与材料

2．1．1 仪器

2．1．2 主要实验材料

2．2 Western-blot法检测蛋白表达

2．3 免疫组织化学法

2．4 实验结果与分析

2．4．1 AAI致比格犬肝组织中FOXO1／p-FOXO1蛋白表达情况

2．5 讨论

2．6 小结

3 全文结论

参考文献

综述

作者简历及在学期间所获研究成果