卵母细胞转录组的调节及其在卵泡存活和早期胚胎发育中的作用

摘要

卵泡是卵巢结构和功能的基本单位，能够产生成熟的卵子并合成雌激素维持正常的生理周期。其中，原始卵泡作为雌性生殖细胞的储存库，在成年个体中不再增加，只会随着生殖活动不断减少。所以卵巢中原始卵泡的规模直接决定了雌性生育年龄，过早消耗将导致卵巢早衰的发生。但是卵泡维持的分子机理和卵巢早衰的发病机制的研究还有很多未知内容。本研究中，我们利用卵母细胞特异性的基因敲除模型来研究卵母细胞发育、卵母细胞减数分裂和早期胚胎发育过程中转录组的变化以及表观遗传调节因子在这些生理过程中的作用，阐明雌性生殖力维持的重要机制，为临床上不孕不育的病例提供新的科学解释和科学依据。因此，本课题分别研究了E3泛素化连接酶CRL4复合体、CpG结合蛋白CFP1和转录辅因子YAP在雌性生殖中的作用，系统地分析了转录组调节在卵母细胞维持和合子基因组激活中的作用。
　　我们的研究发现CRL4通过激活TET家族DNA去甲基化酶的作用，调节卵母细胞中基因的表达和受精后雄原核的去甲基化，从而维持卵母细胞的存活和促进受精卵的发育，在雌性生殖力维持中发挥至关重要的作用。如果CRL4的功能缺失，就会导致卵母细胞死亡，发生卵巢早衰和胚胎受精后不发育。在这些敲除的卵母细胞中，很多卵母细胞里高表达基因的表达量显著降低，而这些基因启动子中CpO岛的甲基化水平明显升高。而且DDB1(damaged DNA binding protein1)敲除的卵母细胞受精后大部分不能发育到四细胞，早期胚胎发育所必需的基因的甲基化水平大幅升高，从而导致基因沉默。进一步的机理研究发现，CRL4通过调节TET家族DNA去甲基化酶的作用，调节卵母细胞中基因的表达和受精后雄原核的去甲基化，从而维持雌性生殖力。
　　DNA结合蛋白CFP1是组蛋白甲基化复合体SET1中的重要亚基，识别基因组中处于非甲基化状态的CpG，介导特定染色体区域组蛋白H3K4的三甲基化，从而调控大量基因的转录。我们的研究发现CFP1敲除的雌鼠完全不育。CFP1在卵母细胞中调节下游基因转录，敲除CFP1造成母源mRNA不能积累，导致卵母细胞不能维持以及卵母细胞受精后不能发育。这些结果说明CRL4活性缺失造成的DNA高甲基化和CFP1敲除导致的mRNA转录下降都严重地阻碍了卵母细胞的维持和重编程能力，造成卵巢早衰和雌性不育，阐明了母源mRNA积累对于雌性生殖能力的重要作用。
　　另外一方面，我们还研究了转录辅因子YAP在合子基因组激活中的功能。YAP在卵母细胞和早期胚胎中高表达，但是在卵母细胞中却定位在细胞质中，不能与转录因子TEAD结合发挥转录活性。但是在受精后，YAP进入细胞核，暗示了YAP-TEAD在早期胚胎发育中的作用。因此我们特异性地在卵母细胞中敲除了Yap1基因（编码YAP蛋白）。结果发现，Yap1敲除的卵母细胞虽然能够正常成熟和受精，但是形成的早期胚胎却发育迟缓，并在三四天内死亡。追踪这些胚胎的死亡原因，发现是许多对于早期胚胎发育至关重要的基因不能及时被表达出来，其中包括两个分别参与核酸和蛋白质合成的两个重要基因Rrm2(ribonucleotide reductase2)和Rpl13(ribosomal protein like13)。通过这个研究，我们发现母体在卵细胞中储存了转录辅因子YAP，又利用输卵管液中的LPA在胚胎发育早期激活了它们，从而在MZT过程中及时启动了胚胎基因转录。这些结果为辅助生殖和胚胎工程技术的进一步改进提供了新的思路。

目录

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致谢

摘要

缩略词表

图表目录

第一章 绪论

1．1 卵巢和雌性生殖

1．2 卵母细胞中转录组和表观遗传修饰的动态变化

1．3 总结

第二章 材料和方法

2．1 动物实验

2．1．1 敲除小鼠的获得

2．1．2 雌鼠生殖力测试

2．1．3 小鼠超数排卵

2．1．4 FSH和LH水平测定

2．2 胚胎实验

2．2．1 卵母细胞的获取和培养

2．2．2 早期胚胎的获取和培养

2．2．3 体外受精

2．2．4 显微注射

2．2．5 核移植和孤雌激活

2．3 形态学实验

2．3．1 石蜡包埋切片

2．3．2 苏木精-伊红染色

2．3．3 免疫组化染色

2．3．4 卵母细胞染色体铺片和计数

2．3．5 免疫荧光染色

2．3．6 5hmC和5mC染色

2．3．7 卵泡计数

2．3．8 TUNEL分析

2．4 分子生物学实验

2．4．1 基因型鉴定

2．4．2 RNA提取和荧光实时定量PCR

2．4．3 DNA甲基化测序

2．4．4 Dot blot

2．4．5 点突变

2．4．6 RNA-seq

2．5 细胞实验

2．5．1 细胞培养

2．5．2 RNA干扰

2．5．3 转染

2．5．4 荧光素酶报告基因分析

2．6 生化实验

2．5．1 Western blot

2．5．2 免疫共沉淀

2．5．3 泛素化分析

第三章 CRL4复合体维持卵泡存活和雌性生育年龄

3．1 引言

3．2 CRL4-DCAF1复合体在卵母细胞中的表达模式

3．3 CRL4活性缺失导致卵巢早衰

3．4 CRL4复合体维持卵母细胞DNA低甲基化和基因表达

3．5 CRL4复合体激活TET家族DNA双加氧酶

3．6 CRL4影响激活卵泡的存活和排卵

3．7 CRL4控制卵母细胞重编程能力

3．8 讨论和总结

第四章 CpG结合蛋白CFP1参与卵母细胞转录组调节

4．1 引言

4．2 H3K4me3和CFP1在卵母细胞中的表达模式

4．3 卵母细胞特异性的CFP1敲除造成卵巢早衰

4．4 CFP1敲除的卵母细胞受精后不发育

4．5 CFP1维持卵母细胞基因组转录活性

4．6 讨论和总结

第五章 转录辅因子YAP在受精后合子基因组激活中的作用

5．1 引言

5．2 转录辅因子YAP在卵母细胞和早期胚胎中的表达和定位

5．3 母源性YAP缺失造成早期胚胎发育缺陷

5．4 YAP在早期胚胎中调节的下游基因

5．5 LPA激活早期胚胎中的YAP

5．6 讨论和总结

第六章 总结

参考文献

附录

作者简历