新型LED人工光源的眼生物安全性的实验研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 不同相关色温的LED白光辐射对人晶体上皮细胞氧化应激及DNA损伤的实验研究
　　目的:
　　氧化应激造成的晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLECs)损伤是白内障形成的最重要因素之一。发光二极管(light-emitting diodes，LED)产生的复色白光中含有高比例的短波蓝光成分，长期的LED白光暴露可能造成对HLECs氧化损伤。本研究探讨了不同相关色温(correlated color temperature，CCT)的LED白光对体外培养的HLECs的细胞增殖，细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，DNA损伤，细胞周期及凋亡的影响，初步探究LED光源的眼生物安全性。
　　方法:
　　培养的HLECs暴露于CCT分别为2954K，5624K及7378K的LED复色白光辐射下，LED系统（中国鸿雁电器科技公司提供）光照循环周期为16小时-开/8小时-关。在不同光照度及不同时间的光辐射暴露后，利用CCK-8法检测细胞增殖，2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐(H2DCFHDA)探针法检测胞内ROS，碱性彗星试验检测DNA损伤，流式法检测细胞周期及细胞凋亡，蛋白免疫印迹及实时定量PCR(RT-qPCR)检测PARP-1，p53及p21 mRNA及蛋白表达。
　　结果:
　　与正常对照组相比，在1500lux的7378K LED白光刺激2天后，细胞增殖活力的显著降低，而2954K组及5624K组未观察到显著性改变。在2500lux7378KLED白光刺激3天后，HLECs的细胞活力下降68.26％;在不同光照度及辐射时间下，7378K组造成了细胞内最为显著的ROS增加;碱性彗星实验显示2954KLED白光对DNA未造成显著的损伤，而5624K组及7378K组DNA损伤均显著增多;5624K及7378K1500lux刺激2天后，HLECs出现G2/M期阻滞，而2954K组无显著改变;仅7378K组在1500及2500lux光照度下可以引起显著的细胞凋亡增多，PARP-1，p53及p21 waf1/cip1表达均显著上升。
　　结论:
　　与2954K及5624K LED白光相比，CCT较高的7378K LED复色白光暴露能诱导HLECs内ROS的过度生成，从而抑制细胞增殖活力，造成显著的DNA损伤，诱导了细胞G2/M期阻滞及凋亡。
　　第二部分 两种不同相关色温的LED白光辐射对人原代视网膜色素上皮细胞病理性细胞因子表达影响及相关信号通路机制研究
　　目的:
　　年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是老年人失明的主要原因。最近的系统性回顾研究显示，过度的日光（含蓝光）暴露增加AMD的患病风险。随着高效的发光二极管(light-emitting diodes，LED)发光技术在我们生活环境中的广泛使用，LED产生的大量蓝光对眼组织的潜在氧化应激损伤威胁不容忽视。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)是眼组织病理性细胞因子的主要来源，调节外层视网膜局部炎症反应和血管生成。本研究探讨了两种不同相关色温(correlated color temperature，CCT)的LED白光对分离的原代人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells，RPECs)几种病理性细胞因子表达、分泌的影响及其相关分子机制。
　　方法:
　　采用改良的二步酶化法从从正常捐献者眼球中分离人原代RPECs，以合适的细胞密度种板生长至融合。CCT分别为2954K和7378K的两种复色白光LED以1500lux光照度，2h-开/20min-关的光照周期辐射刺激已融合的原代细胞。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测VEGF-A，IL-6，IL-8及MCP-1蛋白分泌及基因表达变化。采用蛋白免疫印迹技术检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，蛋白激酶B(Akt)，Janus激酶(Janus kinase，JAK)和核转录因子(Nuclear factor-κB，NF-κB)等信号通路在LED光刺激后的活化程度。采用氯甲基-2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐(CM-H2DCFDA)检测胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平。此外，抗氧化剂及信号通路的靶向分子抑制剂用于进一步研究相关机制。
　　结果:
　　我们通过改良的酶化法成功地从捐献者眼杯中分离出具有生长活性的原代RPECs，以适宜的种板密度使得原代细胞在体外生长融合后，仍保持了RPECs的上皮表型;分离培养的原代RPECs基础状态下具有旺盛的细胞因子分泌特征，显著高于永生化ARPE-19细胞株;ELISA及RT-qPCR的结果显示7378K LED白光刺激原代RPECs刺激后，VEGF-A，IL-6及IL-8蛋白分泌及基因表达均显著增高， MCP-1显著降低，而2954K组未发生类似改变;信号通路分子的免疫印迹实验显示7378K LED白光可显著激活MAPKs(ERK1/2， p38 MAPK及JNK1/2)及核蛋白NF-κB信号通路;机制分析提示:清除细胞内ROS及靶向抑制MAPKs和NF-κB信号通路可显著缓解7378K LED白光诱导的相关病理性细胞因子的变化。
　　结论:
　　高CCT的7378K LED白光可通过激活MAPKs及NF-κB信号通路，造成人原代RPECs中VEGF-A，IL-6，IL-8及MCP-1的表达变化。抗氧化剂及MAPKs、NF-κB信号通路靶向分子抑制剂可显著缓解LED白光诱导的相关病理细胞因子的变化。
　　第三部分 不同相关色温的LED白光辐射对小鼠视网膜组织损伤及全基因组表达谱的影响
　　目的:
　　与传统人工光源及日光光谱不同，如今普及使用的新型发光二极管(light-emitting diodes，LED)白光光谱中具有一个强烈的短波蓝光波峰。LED产生的高强度的蓝光可能存在着对视网膜的潜在光毒性损伤，引起人们对其生物安全性的担忧。通过优化LED光谱可能有助于减少其造成的视网膜光毒性，本研究探讨了不同相关色温(correlated color temperature，CCT)的LED白光对小鼠视网膜组织损伤及视网膜组织全基因表达谱的影响。
　　方法:
　　正常10周龄雌性Babl/c小鼠暴露于CCT分别为2954K，5624K及7378K的LED复色白光辐射下，以250、500、1000、3000lux光照度，刺激7天、14天及28天（光照周期为12小时-亮/12小时-暗）。在不同光照度及不同时间的LED白光辐射后，利用苏木精伊红(Hematein and Eosin，H&E)染色检测视网膜组织形态学，原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法检测视网膜外核层(outer nuclear layer，ONL)细胞凋亡，并采用小鼠视网膜Affymetrix GeneChip Mouse Genome4302.0全基因组表达谱芯片比较2954K及7378K两种不同CCT的LED白光对小鼠视网膜基因表达的整体差异性。
　　结果:
　　H&E染色结果显示:光辐射损伤导致小鼠的视网膜损伤主要表现为ONL变薄，细胞核数量减少。7378K LED白光，250lux刺激28天后， ONL细胞核数量显著减少。而2954K LED白光直至光照度提升至3000lux才导致小鼠ONL数量显著下降，数量下降趋势仍低于7378K组;在3000lux光照度刺激下，5624K组及7378K组小鼠ONL出现了显著增多的TUNEL阳性细胞核，而在1000lux光照度刺激下，未观察到显著增多的阳性细胞;小鼠视网膜全基因表达谱芯片分析显示:7378K与对照组比较中，121个基因表达上调，458个基因表达下调，而在2954K与对照组比较中，59个基因表达上调，仅4个基因表达下调;对差异基因的GO和KEGG富集分析，7378K组的差异表达基因，参与了341个相关Term/GO，16条相关Pathway;2954K组差异表达基因，参与12个Term/GO，7条相关Pathway。
　　结论:
　　LED白光对小鼠视网膜损伤呈现CCT依赖性，7378K LED白光更易造成小鼠视网膜损伤，显著降低ONL细胞核数量，然而细胞凋亡途径可能并非是唯一的损伤机制。小鼠视网膜表达谱芯片分析结果进一步支持了2954K及7378K两种不同CCT的LED白光对小鼠视网膜影响的差异性，通过优化CCT参数有助于提高LED光源的生物安全性。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表(Abbreviation)

引言

参考文献

第一部分 不同相关色温的LED白光辐射对人晶体上皮细胞氧化应激及DNA损伤的实验研究

1 前言

2 材料及方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分 两种不同相关色温的LED白光辐射对人原代视网膜色素上皮细胞病理性细胞因子表达影响及相关信号通路机制研究

1 前言

2 材料及方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第三部分 不同相关色温的LED白光辐射对小鼠视网膜组织损伤及全基因组表达谱的影响

1 前言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

总结

综述 细胞自噬在光辐射诱导视网膜应激损伤中的研究进展

个人简历及在读期间发表文章