基于肠道易吸收纳米对比剂的大肠肿瘤MR成像研究

摘要

目的:以多功能固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLNs)为载体，负载磁共振对比剂钆喷替酸葡甲胺（gadolinium diethylenetriaminepentaacetic acid，Gd-DTPA）及异硫氰酸荧光素（octadecylamine fluorescein isothiocyanate，FITC）而制备的肿瘤易吸收的多功能磁共振(magnetic resonance，MR)纳米对比剂，通过该MR纳米对比剂体外细胞及动物模型直肠给药，体外细胞及大肠壁吸收纳米对比剂后于SET1WI序列MR增强显示不同细胞模型、正常肠壁及肿瘤，探讨成像机制，以建立大肠肿瘤新型MR成像方法。
　　方法:以硬脂酸、FITC及Gd-DTPA为原料，采用乳化-溶剂挥发法合成Gd-FITC-SLN。首先，通过激光粒度分析仪和扫描电镜检测纳米颗粒粒径，Zeta电位分析仪检测其表面电荷，荧光分光光度计测试其包封率，最后通过加速稳定性试验测试纳米材料的稳定性，从而完成该材料的表征测试。其次，以人结肠癌细胞(HT29)和小鼠结肠癌细胞(CT26)为细胞研究模型，通过CCK-8，流式细胞术，免疫荧光结合共聚焦激光扫描显微镜，完成纳米材料的细胞毒性、细胞吸收及亚细胞定位研究;并采用MR成像技术探索细胞水平成像机制。接着，取50只正常C57BL小鼠随机分成两组，分别予小鼠Gd-FITC-SLN（10g/Kg体重）或蒸馏水灌肠给药，观察实验组(Gd-FITC-SLN)有无死亡或明显毒性反应，并于14天后取结肠组织进行组织病理切片，并分析其血液学和血清生化学检查，以完成纳米材料对小鼠体内毒理试验。然后，动物活体成像部分，通过氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(azoxymethane/dextran sulfate sodium，AOM/DSS)诱导雌性C57BL小鼠结肠肿瘤（高级别上皮内瘤变），采用3.0-T高场强MR成像系统(GE，SIGNAHD)与特制鼠类专用线圈，将小鼠分为(1)实验组Gd-FITC-SLN(40 mg/mL，N=4)与(2)对照组Gd-DTPA(13.92 mg/mL，N=4)两组，分别进行对比剂直肠灌注，分别于灌肠前、保留灌肠后20分钟、40分钟、60分钟和80分钟动态扫描，主要扫描序列为SE T1WI序列，基本参数如下:TR/TE，550/15 ms;四个不同的TI(500，650，800，950 ms)便于检测T1值。最后，取正常大肠壁及病变组织进行组织细胞学分析。
　　结果:该纳米对比剂平均粒径220nm，Gd-FITC-SLNs中平均Gd-DTPA负载率为29.76±4.48％(w/w)，Gd-DTPA的包封率为55.00％。两种大肠癌细胞CT-26和HT-29细胞在Gd-FITC-SLNs的浓度范围分别为0-200μg/mL和0-600μg/mL时无明显细胞毒性(P＞0.05);同时这两种细胞对于Gd-FITC-SLNs有明显摄取且具有浓度依赖性(P＜0.001)，纳米对比剂主要分布在细胞浆内。小鼠体内毒理试验中，小鼠均没有死亡或明显的毒性反应。对于AOM/DSS诱导C57BL小鼠肿瘤模型活体成像，对比剂保留灌肠20分钟，期间正常肠壁与肿瘤组织对于对比剂均有吸收强化，但两者强化程度不同，肿瘤强化程度低于正常肠壁。实验组中结肠肿瘤的信噪比(SNRs)增加了2.29倍，较对照组有显著强化(P＜0.001)。共聚焦荧光显微镜也证实纳米对比剂在肿瘤中的分布有差异，肿瘤包膜下分布较肿瘤实质内多。
　　结论:1.负载Gd-DTPA及FITC的固体脂质体纳米粒具备肠道易吸收、Gd-DTPA负载量大、高顺磁性以及组织学可直接检测等特点。
　　2.体外不同大肠癌细胞对于该纳米对比剂均有明显快速吸收，可以实现细胞水平成像。
　　3.该纳米对比剂细胞及小鼠体内毒理实验验证了安全性，有望实现临床转化。
　　4.基于固体脂质体纳米粒的新型MR大肠成像方法在大肠肿瘤模型中的应用表明该方法具有可行性，并有助于肿瘤早期诊断，开辟一种新型分子MR成像方法。