儿童肠道分节丝状菌(SFB)年龄分布特征及其与肠黏膜免疫关系初探

摘要

背景:
　　分节丝状菌（Segmented Filamentous Bacterium，SFB）一种革兰氏阳性、产芽孢厌氧菌，广泛存在于多种脊椎动物及无脊椎动物肠道内的一类形态结构特异的“原著”细菌。这种细菌与宿主的免疫成熟息息相关，它能促进宿主分泌型免疫球蛋(sIgA)的分泌、调控T细胞的分化和平衡、诱导Th17细胞的分化、抵抗外来致病菌的感染。由于SFB难以在体外培养，所以其研究结果多通过单一定植的动物模型，如大鼠、小鼠、鸡等获得。通过单一定植SFB的动物模型研究发现SFB能明显促进肠腔sIgA分泌、诱导Th17细胞的分化，两者均是局部肠道黏膜免疫屏障重要功能分子。sIgA能抑制肠道内的细菌黏附肠道黏膜表面，中和肠道内的毒素、酶和病毒，对一些抗原物质具有封闭作用，同时具有对嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒作用和ADCC作用（抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用）;Th17细胞在适当浓度下能阻止黏膜表面免受细菌及真菌的感染。同时SFB的定植能通过调控Treg细胞的分化，防止Th17细胞过度分化引起的自身免疫性反应。多项研究表明SFB在动物（如小鼠、大鼠和鸡）肠道中定植存在年龄依赖关系，但SFB在人类肠道中的定植、分布及对宿主免疫系统影响的研究非常少。
　　目的:
　　比较各年龄段儿童肠道SFB分布特征;通过肠液中sIgA测定及回肠末端黏膜免疫相关细胞及Th细胞分化相关转录因子的免疫组化检测，初步分析人肠道SFB定植与肠道黏膜免疫关系。
　　方法:
　　1.儿童肠道SFB年龄分布特征:2013年11月-2014年1月期间在浙江大学医学院附属儿童医院住院的非胃肠道疾病、非感染性疾病的外科疾病患儿作为研究对象，排除抗生素及微生态制剂的应用。共收集177例患儿的新鲜粪便，通过提取粪便DNA，从GenBank中获取SFB序列，根据细菌的16SrRNA/DNA特异性基因序列，设计其特异性引物，进一步通过real-time PCR定量分析确定是否存在SFB，并进行统计学分析。
　　2.SFB与肠黏膜免疫关系初步研究:2012年10月-2014年6月期间在浙江大学医学院附属儿童医院行肠镜检查未发现异常的患儿作为研究对象。收集回盲部新鲜肠液，测定肠液中sIgA浓度，并行统计学分析;对肠镜检查时能取得回肠末端黏膜标本的患儿，通过免疫组化方法，测定回肠末端黏膜IL-17A细胞、上皮内淋巴细胞数量，及与Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞等细胞分化相关的转录因子表达，初步分析SFB与肠黏膜免疫功能的关系。
　　结果:
　　1.人肠道SFB年龄分布特征:177例患儿粪便中检测到SFB34例，阳性率为19.2％;不同年龄者SFB阳性率不同，0-1岁、1-2岁、2-3岁、3-4岁、4-5岁、5-6岁、6-7岁、7-15岁依次为40.0％、47.4％、31.6％、15.0％、11.8％、13.3％、15.4％、3.7％，根据Spearman相关性检测，近似值T=-5.095，P＜0.001，显示SFB主要定植于3岁以内的婴幼儿肠道。
　　2.人肠道SFB与sIgA关系:SFB阳性组24例和SFB阴性组23例，结果显示SFB阳性患儿的肠液sIgA浓度明显高于SFB阴性患儿，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.人肠道SFB与肠黏膜免疫细胞及相关转录因子的关系:SFB阳性组12例和SFB阴性组11例，结果显示SFB阳性组回肠末端黏膜上皮细胞内淋巴细胞数量与SFB阴性组的差异无统计学意义;而SFB阳性组回肠末端黏膜IL-17A细胞数量明显低于SFB阴性组，差异有统计学意义(P＜0.05);与Th1细胞分化相关的转录因子T-bet的表达、与Treg细胞的分化有关转录因子FOXP3的表达、及与Th17细胞分化有关的转录因子ROR-γt的表达在SFB阳性组与SFB阴性组的差异均无统计学意义。
　　结论:
　　人SFB主要在3岁以内婴儿肠道定植;人SFB可促使肠道分泌sIgA;人SFB肠道定植对儿童免疫功能的影响可能与动物SFB有区别。

目录

声明

致谢

摘要

中英文缩略词表

主要仪器设备

1 前言

2 对象与方法

2．1 研究对象

2．2 生化制剂及试剂盒

2．3 实验方法

2．4 统计学处理

3 结果

3．1 标准质粒DNA经PCR扩增产物的鉴定

3．2 样本DNA的扩增曲线及熔解曲线

3．3 样本DNA经过real-time PCR扩增产物的鉴定

3．4 不同年龄组SFB分布特征

3．5 SFB定植与肠道sIgA浓度的关系

3．6 SFB定植对回肠末端黏膜上皮内淋巴细胞和IL-17A细胞数量的影响

3．7 SFB定植对Th细胞分化相关的转录因子的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

分节丝状菌(SFB)对宿主免疫系统影响的研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果