基于离体模式体系的百合小鳞茎发生发育机制研究

摘要

球根花卉，也称为观赏地下芽植物(Ornamental geophytes)，在全球花卉产业中占据重要地位，可应用于切花、盆花及庭院用花。然而，因种球较低的自然繁殖率及较长的童龄期，导致球根花卉新品种育种周期较长，例如，百合约12～15年，郁金香则需20～30年。鳞茎等必须大于某一临界大小时才能满足植株开花的要求，且大球常意味着更高的开花品质。因此，如何加速育种周期，缩短“童龄期”（即幼年鳞茎到成年鳞茎的时间），形成高品质开花球，解决其发生发育问题尤为重要，这对加快育种周期，推动我国球根花卉种球国产化具重要意义。
　　本文以百合（Lilium）为试材，在构建浙江省野生百合离体快繁体系基础上，建立了以东方百合‘索邦’（L.Oriental Hybrids‘Sorbonne’）为主要研究对象的离体模式研究体系，采用外源植物生长添加物质系统研究了鳞茎发育生理生化机制，同时建立了外源正负向调控转录组及表达谱数据库，并克隆了一个淀粉合成代谢关键基因LohAGPS1，最后探讨了一种可用于鳞茎发育生物学研究的天然突变体巨球百合（L.brownii F.E.Brown ex Miellez var.giganteum G.Y.Li&Z.H.Chen），主要研究结果如下:
　　1.百合属植物组织培养及东方百合‘索邦’离体研究模型建立
　　(1)湖州百合（L.lancifolium Thunb）鳞片经4℃冷藏2周后置于200～300mg/L甲基托布津中震荡0.3～1h，70～75％酒精中浸泡20～30s，再浸入含1～2滴吐温-20，质量体积浓度为0.1％～0.2％升汞中15～25min，通过甲基托布津-酒精-升汞三步消毒法建立无菌体系，污染率为24.23％，死亡率为19.14％。鳞片的最佳诱导培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L，平均诱导率为54.55％，可获得4.8个不定芽;出芽后，转移到增殖培养基(6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L)进行增殖培养，获得丛生芽，增殖系数为265％。
　　(2)药百合（L.speciosum Thunb.var.gloriosoides Baker）种子萌发最佳培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，萌发率为83.3％，诱导率为88.9％，平均诱导不定芽数达2.5个;92％以上种子属于子叶出土型;未经剥皮处理的种子在任何培养基上都无法萌动;未剥皮处理污染率为5％，而剥皮处理低至0;种子萌发试管苗染色体倍性为2n=2x=24，未发生遗传变异。
　　(3)以材料易获得，研究较多的东方百合‘索邦’为试材，2％NaClO处理鳞片6min，污染率为0，死亡率为15.2％;最佳诱导培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，平均诱导率为57.6％且平均诱导芽数为6.9个。随后，将材料放于仅含70g/L蔗糖及8g/L琼脂的MS基本培养基进行增殖壮球培养，直至获得足量并来自同一母体材料、生理生化状态一致性高的离体小鳞茎。取直径5～8mm离体小鳞茎接种于上述最佳诱导培养基上，培养35d获得大量芽，筛选芽长1～2cm，基部直径3～5mm的单芽用于后续试验，从而建立了发育生物学问题研究的离体模式体系，具均一性强，可控等优势。芽诱导过程可分为细胞脱分化阶段、生长锥形成阶段、叶原基形成阶段及芽形成阶段，这是关于离体芽诱导过程的首次完整报道。芽的形成为外起源，成熟鳞片中维管束平行分布于薄壁细胞中，并于鳞片尖端汇合，其维管束类型为有限维管柬。在芽形成过程中，细胞中淀粉运输方向大致为从顶部至基部，从鳞片外侧向内侧，循环往复，以供应鳞片基部近轴端新芽形成所需的物质与能量。
　　2.外源添加物质对‘索邦’离体百合发育的影响及其生理生化机制
　　(1)在离体条件下，外源PBZ处理对植株地上部分及根产生抑制，且浓度越高，抑制效果越明显，当浓度为5×10-2mM时，叶片数接近0，根数仅1.3。相应地，随PBZ浓度升高，相对鳞茎重量显著升高，最高达100％。LPBZ处理下，其鳞茎鲜重及直径最佳，75DAT时，分别为396mg及10.7mm，为对照的2.5倍及1.6倍，相对鳞茎重量在69.86～85.38％间，地上及地下部分均衡生长，在培养基中营养消耗殆尽时，仍可保证叶片光合产物向鳞茎的运输。PBZ处理可促进小鳞茎中碳水化合物积累，处理浓度越高，积累效应越明显。多效唑对淀粉合成的促进作用一方面是由于GBSS酶活性的增加，从而导致直链淀粉的合成，另一方面则是在碳饥饿时(60DAT)，有效增强淀粉合成相关酶活性，其中，LPBZ下AGPase在整个发育期活性较高，表明ADPG底物供应充足。外源PBZ处理在膨大初期促进IAA含量，暗示PBZ有利于发育早期细胞的分裂与膨大。抗氧化酶体系中APX，CAT及GR高活性可能和清除15DAT前用于松弛及软化细胞产生的ROS，确保有机体内ROS维持在低水平、稳定平衡的生理含量。
　　(2)外源HA处理(0.2mg/L～20mg/L)可显著提高离体小鳞茎的鲜重，其重量最终分为对照的2.9倍，1.8倍及1.8倍，且低浓度效果最佳，在75DAT时鳞茎鲜重为468mg，鳞茎直径为11.68mm，鳞茎大小为933.17mm3。中高浓度HA处理对于植株地上部分（包括株高及叶片数）促进作用明显，但抑制根生长，LHA则利于根发育，根数最多为14.5，根长最长达5.75cm。随着HA处理浓度升高，相对鳞茎重量逐渐降低，从而打破库-源平衡。HA可促进百合小鳞茎蔗糖、可溶性糖及淀粉等含量，且浓度越高，促进作用越明显。LHA处理下关键淀粉合成酶活性较高，而中高浓度HA处理下则在30DAT时出现增高，且以AGPase及SSS为主，表明淀粉积累主要来自于支链淀粉合成。腐植酸处理并不能增加iPA，ZR，ABA及IAA等鳞茎发育促进型激素的水平。然而，LHA处理下其GA含量显著低于其它处理，提高了整个鳞茎膨大过程中促进型激素/抑制型激素的比值，利于光合产物从芽向地下库器官转运。与之相反地，中高浓度处理下HA赤霉素水平高，这可能与其旺盛的地上部分生长相关。LHA处理还显著提高了SOD，POD，APX，CAT及GR在发育早期活性，其可能用于清除活性氧以保持细胞稳定。
　　(3)外源CPPU处理对于‘索邦’百合试管鳞茎形成影响差异明显，结鳞茎率随处理浓度上升而下降，当浓度为5×10-2mM时，结鳞茎率为0％，此时，形成基部肿胀无鳞片且相对幼嫩的类芽假鳞茎。在中低浓度下CPPU处理可促进地上部株高及叶片生长，而高浓度则不利于其生长，所有CPPU处理均表现出对根系的抑制效应。CPPU处理可通过增强鳞茎对光合产物的竞争能力，从而同化物从叶片中的输出率及在鳞茎中的分配率均增多，即增加库强，因而鳞茎中蔗糖等可溶性总糖含量随CPPU处理浓度上升而升高，然而HCPPU由于叶片畸形较少进行光合作用，积累偏低。CPPU总体上可促进淀粉合成关键酶AGPase，GBSS及SSS等活性，但淀粉含量却显著低于对照，推测是由于CPPU在促进鳞茎淀粉合成同时促进了小颗粒淀粉的降解，其中HCPPU整个发育过程淀粉平均含量为52.37mg/g FW。CPPU处理减少了鳞茎发育过程中内源CTKs水平，而对于ABA及IAA有促进效果，且IAA含量与CPPU处理浓度呈线性关系。HCPPU处理下ABA/GA及IAA/GA的比值在发育过程中前者不断升高而后者不断下降，同时，其峰值在所有处理中最高，暗示其特殊的生理状态，并可能与鳞茎无法成球直接或间接相关。CPPU处理总体上促进抗氧化体系相关酶活性，在45DAT时，对于HCPPU，所有的激素及几乎所有抗氧化酶均出现峰值，这是否为HCPPU前期30％鳞茎形成率而终期鳞茎形成率为0％的转折点，还需进一步研究。
　　(4)以最佳促进型处理LHA(0.2mg/L)、LPBZ(5×10-4mM)为标准，去除培养基中蔗糖，比较不添加蔗糖的最佳外源处理是否仍起作用。结果表明，HA及PBZ可部分表现其特性，如PBZ的株控作用，HA对叶片及根系的促进作用。LHA-SF叶片数达15.5，而LPBZ-SF则为4.2，对照为9.7，分别为添加蔗糖处理的4.85、1.75及4.43倍;三者相对鳞茎鲜重平均值仅为50.32％，而添加蔗糖处理则高达75.97％;处理60天时，LHA-SF及LPBZ-SF鳞茎鲜重分别仅为88mg及82mg。以上结果表明，蔗糖的添加对于离体条件下鳞茎发育必不可少，地上部分过旺生长及根系的不良发育是外在原因，引发源库失衡，而蔗糖则可能同时起了碳源及信号分子作用，调控百合植株光合产物流的方向及相关代谢途径。
　　3.离体小鳞茎发生发育的分子调控路径及关键基因挖掘分析
　　(1)基于Illumina HiSeq2000测序平台采用RNA-Seq首次报道了百合离体条件下的转录组背景信息。拼接获得64,794条unigene，平均长度为776bp，序列总大小约50Mb，约占百合全基因组的0.14％。利用公共数据库共注释33,255个unigene，约占所有转录本的51.32％。采用MISA软件共检测到2，732条潜在SSR位点，并以三核苷酸重复基元序列最多。在KEGG途径中，重点分析了碳水化合物及激素代谢路径，表明其在鳞茎发育中可能发挥的重要作用。bHLH及ERFs转录因子家族对鳞茎的发生及发育可能较为关键。此外，LHCb转录本的高表达暗示鳞茎可能也参与光合作用，故因重新审视离体百合库-源关系。
　　(2)以HCPPU（不结鳞茎型）、LPBZ（鳞茎促进型）及对照（正常结鳞茎型）建立三个转录谱文库，共获得3，663个差异表达基因，包括6种表达模式和聚类。光合作用中捕光色素蛋白复合体LHCB6、LHCA4在CON、LPBZ高表达而早期光诱导蛋白(ELIPs)在HCPPU中表达量高。与生长素相关的AVP1基因及谷胱甘肽s-转移酶GST在鳞茎形成类型中高表达，而生长素早期响应蛋白CH3、茉莉酸途径的转录抑制因子JAZ可能与HCPPU鳞茎形成失败相关;细胞分裂素氧化酶CKX在HCPPU中大量特异性表达，暗示细胞分裂素很可能是重要原因之一，而又以玉米素ZT为最关键的CTKs。氧化还原过程及氧化应激过程则很有可能参与调控鳞茎发生发育中抗氧化酶清除活性氧的过程。蔗糖合酶SUS3在HCPPU中相比LPBZ表达量更高，暗示碳水化合物（尤其是淀粉）积累不足是HCPPU鳞茎无法形成的直接体现。
　　(3)改良CTAB法最适于百合离体小鳞茎RNA的提取，样品质量可满足后续基因克隆等试验。通过RACE技术，首次报道了全长1，929bp的东方百合‘索邦’LohA GPS1（GenBank登录号:KX398951），其中开放阅读框1，569bp，编码522个氨基酸;所编码的氨基酸序列包含底物ATP结合位点，催化位点，底物G-1-P结合位点，激活因子3-PGA结合位点等保守结构域。
　　4.巨球百合——可能用于鳞茎发育研究的天然突变体
　　使用0.1％HgCl2处理巨球百合鳞片8min，污染率为40.00％。当培养基中含1.5mg/L6-BA及0.5mg/L NAA时，芽诱导效果较佳，诱导率为100.00％，平均诱导芽数为5.0个，芽健壮。巨球百合铁的含量为5.84mg/100g，硒元素含量高达0.014μg/kg，为卷丹百合的2.92倍，显示出较高的食用价值，甚至可考虑作为设计功能性食品（保健食品）的原料。巨球百合具鳞茎巨大的特点，作为天然突变体可用于挖掘控制鳞茎发育的相关调控基因。

目录

声明

摘要

缩略语表

图目录

表目录

1 文献综述、研究内容及技术路线

1．1 植物组织培养中外植体灭菌及百合属植物离体快繁体系概况

1．1．1 植物组培中外植体表面灭菌

1．1．2 百合属植物离体快繁体系研究

1．2 鳞茎发育研究模型

1．3 试管鳞茎形成及膨大影响因子

1．3．1 外植体类型、方向性及取材时间

1．3．2 培养基配方及添加剂

1．3．3 培养条件

1．4 鳞茎形成及膨大生理生化机制

1．4．1 蔗糖及碳水化合物代谢

1．4．2 激素调控

1．4．3 抗氧化酶

1．5 鳞茎形成及膨大的分子机制

1．6 转录组学应用及百合属转录组学研究情况

1．6．1 转录组学研究及其应用

1．6．2 百合属转录组学研究概况

1．7 淀粉合成关键酶基因的克隆及功能研究

1．7．1 葡萄糖焦磷酸化酶AGPase

1．7．2 淀粉合成酶GBSS及SSS

1．7．3 淀粉分支酶SBE

1．8 研究目的、内容、技术路线及意义

1．8．1 研究目的

1．8．2 研究内容

1．8．3 技术路线

1．8．4 研究意义

2 湖州百合组培快繁体系建立

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 低温冷藏对湖州百合污染的控制

2．2．2 不同酒精灭菌时间对湖州百合污染的控制

2．2．3 不同消毒剂及消毒时间对湖州百合污染的控制

2．2．4 甲基托布津预浸对湖州百合污染的控制

2．2．5 添加吐温-20对湖州百合污染的控制

2．2．6 不同诱导培养基对湖州百合诱导培养的影响

2．2．7 不同增殖培养基对湖州百合继代培养的影响

2．3 讨论

2．3．1 湖州百合无菌体系的建立

2．3．2 湖州百合快繁体系的建立

2．4 小结

3 药百合无菌播种体系建立

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 剥皮处理对药百合种子萌发的影响

3．2．2 不同激素配比对药百合种子萌发的影响

3．2．3 染色体倍性检测

3．3 讨论

3．4 小结

4 鳞茎发育离体研究模型的建立

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 不同消毒剂对‘索邦’无菌体系建立的影响

4．2．2 不同诱导培养基对‘索邦’诱导培养的影响

4．2．3 ‘索邦’均一离体模式研究体系的建立

4．2．4 离体模式研究体系中的细胞学观察

4．3 讨论

4．3．1 ‘索邦’组培快繁体系的建立

4．3．2 离体研究模型建立的必要性及可行性

4．3．3 离体条件下诱芽的形态发生学

4．4 小结

5 多效唑(PBZ)处理对离体小鳞茎发育的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．1．3 观察与统计

5．2 结果与分析

5．2．1 PBZ处理对‘索邦’小鳞茎形态建成的影响

5．2．2 PBZ处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中NSC含量的影响

5．2．3 PBZ处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中淀粉合成酶活性的影响

5．2．4 PBZ处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中内源激素水平的影响

5．2．5 PBZ处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中抗氧化酶t蛋白活性的影响

5．2．6 PBZ处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中MDA含量的影响

5．3 讨论

5．3．1 低浓度PBZ处理促进‘索邦’试管植株生长

5．3．2 PBZ处理有利于NSC活跃转化

5．3．3 离体条件下PBZ处理对内源激素水平及其平衡的影响

5．3．4 PBZ处理下抗氧化酶、MDA与离体鳞茎形态建成的关系

5．4 小结

6 腐殖酸(HA)处理对离体小鳞茎发育的影响

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 方法

6．1．3 观察与统计

6．2 结果与分析

6．2．1 HA处理对‘索邦’小鳞茎形态建成的影响

6．2．2 HA处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中NSC含量的影响

6．2．3 HA处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中淀粉合成酶活性的影响

6．2．4 HA处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中内源激素水平的影响

6．2．5 HA处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中抗氧化酶／蛋白活性的影响

6．2．6 HA处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中MDA含量的影响

6．3 讨论

6．3．1 低浓度HA处理有利于‘索邦’试管鳞茎膨大

6．3．2 HA处理促进同化物的合成及向下运输

6．3．3 离体条件下HA处理对内源激素水平及其平衡的影响

6．3．4 HA处理下抗氧化酶、MDA与离体鳞茎发生发育的关系

6．4 小结

7 氯吡苯脲(CPPU)处理对离体小鳞茎发育的影响

7．1 材料与方法

7．1．1 材料

7．1．2 方法

7．1．3 观察与统计

7．2 结果与分析

7．2．1 CPPU处理对‘索邦’小鳞茎形态建成的影响

7．2．2 CPPU处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中NSC含量的影响

7．2．3 CPPU处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中淀粉合成酶活性的影响

7．2．4 CPPU处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中内源激素水平的影响

7．2．5 CPPU处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中抗氧化酶／蛋白活性的影响

7．2．6 CPPU处理对‘索邦’小鳞茎发育过程中MDA含量的影响

7．3 讨论

7．3．1 高浓度CPPU处理阻断‘索邦’离体鳞茎形成

7．3．2 CPPU同时促进淀粉合成及分解方向

7．3．3 离体条件下CPPU处理对内源激素水平及其平衡的影响

7．3．4 CPPU处理下抗氧化酶、MDA与离体鳞茎发生的关系

7．4 小结

8 蔗糖对离体小鳞茎发育的影响

8．1 材料与方法

8．1．1 材料

8．1．2 方法

8．1．3 观察与统计

8．2 结果与分析

8．2．1 不添加蔗糖对于外源最适处理形态指标的影响

8．2．2 添加蔗糖与否的不同处理形态指标比较

8．3 讨论

8．4 小结

9 基于ILLUMINA平台的离体百合鳞茎转录组学研究

9．1 材料与方法

9．1．1 材料

9．1．2 RNA的提取、纯化及质量检验

9．1．3 cDNA文库的构建及RNA-Seq

9．1．4 重头组装

9．1．5 测序和拼接数据提交

9．1．6 Unigene功能注释和分类

9．1．7 SSR分析

9．2 结果与分析

9．2．1 离体鳞茎RNA质量及测序均一性分布评估

9．2．2 测序及组装情况

9．2．3 Unigene功能注释

9．2．4 Unigene功能分类

9．2．5 转录因子及转录本分析

9．2．6 KEGG代谢途径分类及注释

9．2．7 SSR鉴定

9．3 小结

10 外源正负向鳞茎发育调控的转录组学差异表达基因研究

10．1 材料与方法

10．1．1 材料

10．1．2 RNA的提取、纯化及质量检验

10．1．3 cDNA文库的构建及RNA-Seq

10．1．4 重头组装

10．1．5 测序和拼接数据提交

10．1．6 Unigene功能注释和分类

10．1．7 基因差异表达分析

10．1．8 差异表达基因聚类分析

10．1．9 不同鳞茎调控方式下最显著差异表达基因的筛选和注释

10．1．10 差异表达基因GO功能富集及KEGG pathway注释对比

10．2 结果与分析

10．2．1 三种处理测序情况

10．2．2 差异表达基因比较

10．2．3 差异基因表达模式聚类分析

10．2．4 差异表达基因的筛选和注释

10．2．5 特异性表达基因的筛选和注释

10．2．6 差异表达基因的GO分类与富集分析

10．2．7 差异表达基因的KEGG代谢途径

10．3 讨论

10．3．1 正负调控下差异表达基因及特异表达基因

10．3．2 正负调控下GO功能及KEGG代谢途径富集

10．4 小结

11 LohAGPS1基因的克隆与分析

11．1 材料与方法

11．1．1 植物材料

11．1．2 菌株与载体

11．1．3 主要试剂与试剂盒

11．1．4 缓冲液、生化试剂和培养基

11．1．5 外源RNase的去除

11．1．6 仪器设备

11．2 试验方法

11．2．1 总RNA的提取

11．2．2 RNA质量检测

11．2．3 引物序列

11．2．4 第一链cDNA合成

11．2．5 AGPS基因全长cDNA扩增

11．2．6 目的片段的回收与纯化

11．2．7 加A

11．2．8 片段与载体的连接

11．2．9 连接产物的转化

11．2．10 阳性克隆的鉴定

11．2．11 LohAGPS1基因cDNA全长的获得

11．2．12 序列测定与分析

11．3 结果与分析

11．3．1 百合RNA提取方法比较

11．3．2 LohAGPS1基因的克隆

11．3．3 LohAGPS1基因的序列与功能分析

11．3．4 LohAGPS1基因的系统进化树分析

11．4 讨论

11．4．1 复杂样品百合的RNA提取

11．4．2 ‘索邦’离体鳞茎LohAGPS1基因全长克隆

11．5 小结

12 巨球百合——可能用于鳞茎发育研究的天然突变体

12．1 材料与方法

12．1．1 材料

12．1．2 方法

12．2 结果与分析

12．2．1 巨球百合组培体系建立

12．2．2 巨球百合鳞茎营养成分分析

12．3 讨论

12．3．1 巨球百合材料的特异性

12．3．2 巨球百合食用性的可开发潜力

12．4 小结

13 结论、创新点及展望

13．1 主要结论

13．1．1 百合属植物组织培养及‘索邦’离体研究模型建立

13．1．2 外源添加物质对‘索邦’离体百合发育的影响及其生理生化机制

13．1．3 离体小鳞茎发生发育的分子调控路径及关键基因挖掘分析

13．1．4 巨球百合——可能用于鳞茎发育研究的天然突变体

13．2 创新点

13．3 不足与展望

参考文献

作者简历及在学期间所取得的科研成果

致谢