杂交水稻穗萌抑制剂筛选及其抑制机理研究

摘要

杂交水稻大多数不育系种子休眠期较短，加上制种过程赤霉素的施用，制种种子成熟过程若遇阴雨天气易发生穗萌，造成重大经济损失。因此研制有效的穗萌抑制剂并探究其抑制机理具有重要意义。本文以杂交水稻品种钱优1号和Y两优689为试验材料，研究了丁香酚和抑制剂组合(丁香酚+烯效唑+马来酰肼(MH))对杂交水稻种子萌发的抑制效果;探究抑制剂对种子萌发过程中生理变化和基因表达的影响以阐释其抑制机理;通过田间试验验证穗萌抑制剂的穗萌抑制效果，最终得到抑制效果较好的三个抑制剂组合。本研究系首次探讨天然产物丁香酚和抑制剂组合抑制杂交水稻种子萌发及其抑制机理，为杂交水稻制种过程穗萌控制及其它禾谷类作物的穗萌抑制研究提供间接依据和理论借鉴。主要研究结果如下:
　　研究了不同吸胀时间和不同发芽程度的钱优1号杂交水稻种子的生理变化。随着种子吸胀和胚根的伸长，可溶性糖含量及α-淀粉酶、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)的活性显著上升;内源激素ABA在种子吸胀初期迅速下降。表明α-淀粉酶、POD、APX、CAT的活性和ABA含量与种子萌发进程相关性较强。
　　研究了丁香酚对钱优1号种子萌发和萌发过程中部分酶活性、内含物质、ABA、GA3、ABA代谢和信号相关基因表达的影响，以及GA3对丁香酚效应的影响。1.5g/L以上浓度的丁香酚对钱优1号种子萌发有抑制作用并嗵浓度上升而增强，且不影响幼苗生长。在吸胀96h内，丁香酚处理的种子中α-淀粉酶、POD、APX和CAT活性显著低于对照，认为丁香酚可通过影响萌发过程酶活性以抑制种子萌发。丁香酚与GA3共同处理后种子的发芽速率介于丁香酚处理和对照之间，认为丁香酚的抑制作用可以被一定浓度的GA3所恢复;在内源激素水平上，丁香酚提高了种子吸胀初期（3h-12h）的ABA含量，同时施加GA3一定程度上可抵消丁香酚对ABA含量的影响;丁香酚和丁香酚与GA3共同处理同样提高了种子中GA3的含量，说明丁香酚提高吸胀种子中ABA含量所产生的抑制萌发效果大于提高GA3含量所产生的促进萌发效果，进而延缓种子的萌发。通过q-PCR分析种子吸胀过程中ABA合成关键酶NCED的五个基因（OsNCED1、2、3、4、5）和分解关键酶ABA8'-羟化酶的三个基因（OsABA8OH1、2、3）的表达情况，推测OsABA8OH2是丁香酚抑制水稻种子萌发过程中ABA分解代谢的主要ABA8'-羟化酶基因，而OsNCED2是丁香酚促进ABA合成作用的主要NCED基因。此外，丁香酚可能通过促进OsABF1的表达以增强ABA信号传递，从而抑制种子的萌发。
　　对三种抑制剂（丁香酚、烯效唑、MH）进行不同浓度的复配和筛选，最终得到抑制效果较好的三个组合(A、G、I)。研究了三个抑制剂组合对钱优1号种子萌发和α-淀粉酶活性、ABA、GA3及ABA代谢和信号相关基因表达的影响。结果表明三个抑制剂组合抑制钱优1号种子萌发的同时显著地抑制了幼苗的生长，这与烯效唑抑制节间细胞伸长有关。三个抑制剂组合均提高内源激素ABA的含量，对GA3含量影响不大，推测丁香酚促进GA3合成效果被烯效唑抵消。在基因表达上，抑制剂组合A和G对吸胀3h的OsABA8OH2的表达有下调作用，但对OsNCEDs的表达量无明显上调效果。抑制剂组合处理种子中OsNC ED2/OsABA8OH2的比值整体显著高于对照，该结果与抑制剂组合处理提高ABA含量的结果相吻合。同样，抑制剂组合处理可能通过促进种子中OsABF1的表达以增强ABA信号的传递，从而抑制种子的萌发。
　　通过田间模拟降雨条件，研究了丁香酚和抑制剂组合对杂交水稻钱优1号和Y两优689穗萌抑制效果，对收获的各处理中未萌发的种子进行发芽试验以检验抑制效果的持续性。丁香酚和抑制剂组合对Y两优689穗萌的抑制效果要强于钱优1号。丁香酚的穗萌抑制效果随浓度上升而增强，2.0g/L丁香酚对钱优1号和Y两优689穗芽的抑制率分别为43.4％（穗芽率从27.9％降至15.80％）和80.0％（穗芽率从5.66％降至1.13％）。抑制剂组合对钱优1号穗萌抑制效果比丁香酚好，而高浓度丁香酚对Y两优689品种的穗萌抑制效果较好。丁香酚对两个杂交水稻品种的抑制效果在贮藏6个月后完全解除。2015年三种抑制剂组合喷施表明，组合I（1.2g/L丁香酚+0.3g/L烯效唑+0.4g/L MH）对钱优1号的穗萌抑制效果最好，穗芽率的抑制率达到60.5％（穗芽率从13.45％降至5.31％），而处理A（0.4g/L丁香酚+0.6g/L烯效唑+0.4g/L MH）对Y两优689的抑制效果较好，穗芽率的抑制率达66.1％（穗芽率从7.60％降至2.58％）。田间试验结果表明，丁香酚和抑制剂组合均能有效抑制杂交水稻穗萌，而对收获种子的发芽率没有显著影响。本研究所筛选的抑制剂及其浓度可供田间生产参考。

目录

声明

致谢

前言

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1．杂交水稻穗萌研究

1．1 穗萌发生的影响因素

1．2 穗萌的危害

1．3 种子休眠相关基因和QTL

1．4 穗萌抑制剂研究

1．5 杂交水稻穗萌抗性鉴定方法

2．内源激素GA和ABA对种子萌发的调控

2．1 GA在种子萌发过程中的作用

2．2 ABA与种子休眠

2．3 GA和ABA在种子从休眠到萌发转变过程的拮抗作用

3．α-淀粉酶与种子萌发

3．1 α-淀粉酶在种子萌发过程的作用

3．2 GA对α-淀粉酶的诱导

3．3 α-淀粉酶合成基因

3．4 α-淀粉酶测定方法

4．烯效唑、马来酰肼和丁香酚在植物上的研究与应用

4．1 烯效唑

4．2 马来酰肼

4．3 丁香酚

第二章 杂交水稻种子萌发过程生理生化变化

1．材料与方法

1．1 试验材料

1．2 种子吸水率测定

1．3 α-淀粉酶活性测定

1．4 可溶性糖含量测定

1．5 可溶性蛋白含量测定

1．6 抗氧化物酶活性测定

1．7 种子内源激素ABA与GA3测定

1．8 统计分析

2．结果

2．1 不同发芽时间杂交水稻种子不同酶活性和内含物质指标差异

2．2 不同发芽程度杂交水稻种子的不同酶活性和内含物质指标差异

3．讨论

第三章 丁香酚对杂交水稻种子吸胀过程激素及相关基因表达的影响

1．材料与方法

1．1 试验材料

1．2 丁香酚水乳剂制备

1．3 种子处理及发芽试验

1．4 α-淀粉酶活性测定

1．5 可溶性糖含量测定

1．6 抗氧化物酶活性测定

1．7 不同发芽程度种子分级和穗芽率与穗萌指数的统计

1．8 内源激素ABA和GA3的测定

1．9 RNA提取

1．10 反转录

1．11 q-PCR扩增

1．12 统计分析

2．结果与分析

2．1 丁香酚对种子发芽和幼苗生长的影响

2．2 丁香酚对种子萌发过程中α-淀粉酶活性的影响

2．3 丁香酚对种子萌发过程中可溶性糖含量的影响

2．4 丁香酚对种子萌发过程中抗氧化物酶活性的影响

2．5 丁香酚对种子萌发过程的影响及GA3的恢复效果

2．6 丁香酚对种子吸胀过程中内源ABA和GA3含量的影响

2．7 丁香酚对种子吸胀过程中ABA代谢关键酶的编码基因表达的影响

2．8 丁香酚对种子吸胀过程中ABA信号途径的转录因子OsABF1和OsABI5表达的影响

3．讨论

第四章 不同抑制剂组合抑制杂交水稻种子发芽及对相关基因表达的影响

1．材料与方法

1．1 试验材料

1．2 种子处理及发芽试验

1．3 抑制剂组合筛选

1．4 α-淀粉酶活性测定

1．5 种子内源激素测定

1．6 ABA代谢相关基因表达分析

1．7 统计分析

2．结果与分析

2．1 不同抑制剂组合对种子发芽和幼苗生长的影响

2．2 抑制剂组合对种子萌发过程中α-淀粉酶活性的影响

2．3 抑制剂组合对种子吸胀过程中内源ABA和GA3含量的影响

2．4 抑制剂组合对种子吸胀过程中ABA代谢基因表达量的影响

2．5 抑制裁组合对种子吸胀过程中ABA信号途径的转录因子OsABF1和OsABI5表达的影响

3．讨论

第五章 丁香酚和抑制剂组合对田间穗萌抑制的效果

1．材料与方法

1．1 试验材料

1．2 田间穗萌环境建立

1．3 抑制剂田间喷施处理

1．4 穗萌抑制效果及其持续性分析

1．5 统计分析

2．结果与分析

2．1 田间喷施丁香酚处理的穗萌抑制效果分析

2．2 田间喷施不同抑制剂组合的穗萌抑制效果分析

3．讨论

总结

参考文献

博士期间发表或完成论文和专利