水稻紫色酸性磷酸酶OsPAP10a和OsPAP10c的功能研究

摘要

磷是植物生长发育所必需的大量元素之一。自然界中磷含量相当丰富，但大部分以有机磷化合物形式存在，能被植物直接吸收利用的无机磷含量常常低于植物生长所需的浓度，农业生产中需要大量施用磷肥来实现作物高产。但磷肥的过度使用，不仅增加了生产成本，也是水体富营养化的重要成因。提高作物的磷养分吸收效率，对农业可持续发展的意义重大。
　　缺磷条件下，植物能合成并向根外分泌紫色酸性磷酸酶(Purple acidphosphatases，PAPs)，从而水解植物根部周围的有机磷化合物，释放出无机磷供植物生长所需。研究表明，PAP Ia亚家族在植物有机磷的利用及缺磷适应中具有重要作用。水稻PAP Ia亚家族包括OsPAP10a、OsPAP10b、OsPAP10c、OsPAP10d和OsPAP26。定量逆转录PCR(qRT-PCR)分析显示，Os PAP10a在地上部分和地下部分均受缺磷特异诱导，而Os PAP10c只在地下部分受缺磷特异诱导。OsPAP10b和OsPAP10d在各组织和各个发育时期表达都很低，而OsPAP26在各个组织中均有较高的表达。本研究主要对象是PAP Ia亚家族的OsPAP10a和OsPAP10c的功能。
　　通过构建OsPA尸10a和Os PAP10c启动子融合GUS报告基因的载体并利用农杆菌介导转基因技术迸行遗传转化，研究获得了OsPAP10a和Os PAP10c启动子融合GUS报告基因转基因株系。转基因植株的GUS染色分析证实了OsPAP10a在地上部分和地下部分均受缺磷特异诱导，而OsPAP10c只在地下部分受缺磷特异诱导。根部切片显示，OsPAP10a和Os PAP10c主要表达于根的表皮和外皮层，OsPAP10c在叶、幼穗和花粉中都有表达。
　　根表面酸性磷酸酶(Acid Phosphatase，APase)活性定性染色（BCIP染色）结果表明，OsPAP10a和Os PAP10c超表达株系根表面的染色增强，但超表达OsPAP10c的转基因株系根表面的染色深于超表达Os PAP10a的转基因株系。利用APase活性定量分析，检测了植物根表面、植物地上和地下部分组织中、及悬浮细胞培养的介质（水培液）中的APase活性。结果表明，与野生型(Wild Type，WT)植株相比，超表达OsPAP10c使根表面APase活性增加约10倍，而超表达OsPAP10a使根表面APase活性仅增加2倍;OsPAP10c超表达株系地上和地下部分组织中APase活性增加约5倍，而OsPAP10a超表达材料仅增加1.5-2倍;在供磷条件下，超表达OsPAP10a的转基因悬浮细胞培养液中的APase活性较其野生型对照提高了近2倍，而超表达OsPAP10c使悬浮细胞培养液中的PAP酶活提高了10倍以上。可见，OsPAP10c在水稻中较OsPAP10a具有更显著的功能和应用潜力。
　　植株地上和地下部分组织的总蛋白经非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及APase活性染色后，清晰地获得了APase同工酶的条带。结果表明，Os PAP10a超表达株系增加A2条带活性。OsPAP10c超表达株系诱导A1、A3、A4和A5条带。活性胶染色和Western蛋白印迹分析悬浮细胞培养液中的蛋白发现，OsPAP10c在水稻细胞中主要分泌到细胞外，因而在培养液中大量存在。
　　为了明确OsPAP10a和Os PAP10c基因在培育磷养分高效水稻品种中的应用前景，研究还对二基因的超表达株系进行了有机磷(ATP)降解实验。结果表明，OsPAP10c超表达株系能显著提高ATP降解速率及利用效率。在只添加有机磷的水培溶液培养5天时，野生型叶片磷含量降低56％，而OsPAP10a超表达材料叶片磷含量只下降25％，OsPAP10c超表达材料叶片磷含量仅下降8％到24％。
　　综上所述，本论文对水稻OsPAP10a和OsPAP10c两个紫色酸性磷酸酶的功能进行分析和比较。相比于OsPAP10a，OsPAP10c是一个更为重要的分泌型酸性磷酸酶，在细胞外有机磷利用中具有重要的作用，在水稻磷高效品种改良中具有潜在的应用前景。

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缩略语表

摘要

第一章 文献综述

1．1 高等植物对低磷胁迫的响应

1．1．1 根系构型的改变

1．1．2 高亲和磷酸盐转运体基因的诱导表达

1．1．3 有机暖的分泌

1．1．4 磷酸酶的产生和分泌

1．1．5 菌根的形成

1．1．6 其他生物学变化

1．2 紫色酸性磷酸酶

1．2．1 植物PAPs生物信息学分析

1．2．2 植物PAPs生化和分子特性

1．2．3 植物PAPs亚细胞定位

1．2．4 植物PAPs表达调控

1．3 磷营养高效作物品种改良

1．3．1 调节核心转录因子和其他磷酸盐调节蛋白的表达

1．3．2 调节磷陵盐转运蛋白的表达

1．3．3 调节有机酸的合成与转运

1．3．4 调节磷酸酶的分泌

1．4 本研究的目的和意义

第二章 材料方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 植物生长条件

2．2．2 进化树构建

2．2．3 载体构建

2．2．4 RNA提取与纯化

2．2．5 半定量PCR(RT-PCR)与实时定量PCR(qRT-PCR)分析

2．2．6 OsPAP10c多克隆抗体的制备

2．2．7 Western蛋白印迹分析

2．2．8 农杆菌介导的水稻转基因

2．2．9 农杆菌介导的拟南芥转基因

2．2．10 BCIP(5-澳-4-氯-3-吲哚-磷酸盐)染色

2．2．11 GUS染色与切片制作

2．2．12 植物组织和培养液中的蛋白提取

2．2．13 酸性磷陵酶活性测定

2．2．14 活性胶染色实验

2．2．15 水稻磷含量测定

2．2．16 田间表型分析

2．2．17 总磷测定

第三章 水稻紫色酸性磷酸酶Ia亚家族的表达调控

3．1 PAP Ia亚家族成员及其表达分析

3．1．1 植物PAP Ia亚家族进化分析

3．1．2 水稻PAP Ia亚家族基因在不同组织中的表达分析

3．2 OsPAP10c在地上和地下部分受缺磷特异诱导表达

3．2．1 OsPAP10c的定量分析

3．2．2 OsPAP10c的组织表达分析

3．3 OsPAP10c在地下部分受缺磷特异诱导表达

3．3．1 OsPAP10c的定量分析

3．3．2 OsPAP10c的组织表达分析

第四章 紫色酸性磷酸酶OsPAP10c和OsPAP10c的功能研究

4．1 OsPAP10c和OsPAP10c与拟南芥AtPAP10的功能互补关系

4．2 超表达OsPAP10a和OsPAP10c植株的培育与鉴定

4．3 超表达OsPAP10a和OsPAP10c植株的酸性磷酸酶活性检测

4．3．1 根表面酸性磷酸酶活性检测

4．3．2 根和叶中酸性磷酸酶活性检测及活性胶染色分析

4．3．3 分泌性酸性磷酸酶活性检测及活性胶染色分析

4．4 超表达OsPAP10a和OsPAP10c对胞外ATP的降解和利用效率分析

4．5 超表达OsPAP10a和OsPAP10c植株的田间表型分析

4．6 讨论

第五章 结论与展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间主要的研究成果