向日葵应对列当侵染的作用机理研究及外源水杨酸的缓解效应

摘要

向日葵列当（Orobanche cumana Wallr.）为全寄生草本植物，可寄生在向日葵(Helianthus annuusL.)的根部，获取水分和养分，从而对寄主向日葵产生不利影响，包括生长迟缓、产量与品质下降，严重时还会引起植株死亡。同时，土壤中巨大的列当种子库、防治时间的难以准确预测以及新的向日葵列当生理小种的迅速出现，使得目前对向日葵列当的防治方法显得不尽如人意。本实验以前期鉴定的向日葵抗性品种JY207和感性品种TK0407作为实验材料，在向日葵列当侵染条件下，通过比对不同抗性向日葵品种之间植株生长、生理生化以及蛋白表达水平的差异，来探讨向日葵列当对向日葵的作用特性以及向日葵的抗性机制，为向日葵抗性品种的选育提供理论指导。同时，将感性品种向日葵种子进行外源水杨酸的预处理，诱导向日葵产生防御反应，提高对向日葵列当的抵抗力，为防治向日葵列当提供了新的思路。主要研究结果如下:
　　(1)向日葵列当侵染以后，向日葵感性品种TK0409中活性氧自由基(ROS)的水平显著提高，而在抗性品种JY207中，只有H2O2的含量略有上升而OH-和O2-的含量无明显变化，同时，两个品种中抗氧化物酶的活性均显著提高，表明向日葵列当的侵染在向日葵中会引起ROS的积累。然而，抗氧化物酶的活性增强程度在两个品种中却并不相同，POD和APX在两个品种中活性提高的程度无差异，SOD的活性在TK0409中更高，而CAT和GR的活性在JY207中更高，这些结果表明对ROS的清除机制的激活程度，可能决定着向日葵的抗性能力。此外，受到向日葵列当侵染以后，JY207中木质素含量要显著高于TK0409，表明木质素的积累可能也有利于向日葵产生对列当的抗性。而向日葵根系分泌物中促进列当种子萌发的刺激物，其种类和含量的差异可能也与向日葵的抗性相关。
　　(2)利用iTRAQ技术，鉴定了两个品种向日葵JY207和TK0409受到列当侵染前后差异表达的蛋白。两个品种均鉴定出超过3500个蛋白，其中抗性品种JY207包含706个差异表达的蛋白而感性品种TK0409中总共有866个差异表达的蛋白。这些蛋白的主要生化过程包括小分子代谢、生物合成、细胞内氮复合代谢、运输过程、碳水化合物代谢过程和分解代谢过程。将差异表达蛋白比对到KEGG数据库中，发现其主要代谢途径包括碳代谢作用、氧化磷酸化、氨基酸合成、核糖体、RNA运输等。利用SRING数据库来预测差异蛋白质之间的相互作用，JY207中上调蛋白之间的互作主要涉及到核糖体、氧化磷酸化途径以及蛋白酶相关蛋白，而下调蛋白之间的互作主要涉及到次生代谢途径。TK0409中上调蛋白的互作主要涉及核糖体蛋白而下调蛋白主要涉及次生代谢途径和碳水化合物代谢。对抗性相关的蛋白进行鉴定，发现向日葵对向日葵列当的抗性可能涉及到多种信号途径，是多种机制的综合表现，包括对列当萌发刺激物的调节机制、对入侵寄生物的识别机制、防御相关蛋白的积累、木质素的合成、有毒代谢产物的解毒机制以及对植物生长调节剂的调节作用。此外，决定品种为感性还是抗性，可能与植株受到侵染后抗性机制被激活的速度、程度以及效率有关。本研究中鉴定出来的蛋白质，为反向基因研究以及进一步研究向日葵应对列当侵染的抗性机制提供理论参考，同时可用于辅助向日葵的抗性育种。
　　(3)在列当寄生的条件下，水杨酸在感性品种向日葵形成自身防御反应的过程中发挥着重要作用。向日葵被列当寄生后，其生物量急剧下降，而外源水杨酸对向日葵种子预处理后，这种下降趋势有一定程度的减缓。在被向日葵列当寄生的条件下，随着外源水杨酸含量逐渐升高（从0.5到1mM），与阳性对照组（未施水杨酸）相比，向日葵中H2O2和OH的含量分别从7％和42％增加到14％和114％，而O2-的含量呈略微下降的趋势，APX和CAT的活性在不同浓度(0.5和1mM)的水杨酸作用下分别下降了38％和18％、49％和42％。对于SOD活性，外源水杨酸并未对被寄生的向日葵根部产生影响。被向日葵列当寄生后，大部分基因包括PR基因，一些抗氧化物酶相关基因以及植物激素相关基因都呈上调趋势，而与此不同的是，pal、chs和NPR1的相对表达量分别下降了55％、56％和34％，以及Cu/Zn-SOD、GST和hsr的相对表达量并无显著变化。在被向日葵列当寄生的条件下，外源水杨酸的使用提高了大部分基因的相对表达量，而CAT、lox、PR5-1、HACS.1和chs等基因则无明显变化。这些研究结果表明外源水杨酸通过调节ROS水平、抗氧化酶系统，诱导NPR1、病程相关基因以及其他防御相关基因的表达，使感性品种向日葵形成系统获得性抗性和超敏反应来缓解向日葵列当的侵染。

目录

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致谢

论文说明

表目录

图目录

缩略词

摘要

1 文献综述

1．1 寄生植物简介

1．2 根寄生植物列当的生活史

1．3 向日葵列当的危害

1．4 寄生植物的抗性机制

1．5 向日葵列当的防治措施

1．5．1 化学防治

1．5．2 物理防治

1．5．3 生物防治

1．5．4 抗性品种选育

1．5．5 诱杀作物和诱捕作物

1．6 iTRAQ技术简介

1．6．1 iTRAQ技术原理

1．6．2 iTRAQ技术应用

1．7 水杨酸种子预处理的作用

1．8 研究目的和意义

2 向日葵列当侵染对不同抗性向日葵生长和生理生化的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 试验设计

2．1．2 植物材料与生长条件

2．1．3 形态指标

2．1．4 MDA含量和ROS水平的测定

2．1．5 抗氧化物酶活性测定

2．1．6 谷胱甘肽含量测定

2．1．7 总酚与木质素含量的测定

2．1．8 向日葵根系分泌物对向日葵列当种子萌发的测定

2．2 结果与分析

2．2．1 对品种TK0409和JY207的抗性评价

2．2．2 向日葵列当对向日葵根部MDA和ROS含量的影响

2．2．3 向日葵列当对向日葵根部抗氧化物酶活性的影响

2．2．4 向日葵列当对向日葵根部GSH含量和GSH／GSSG的影响

2．2．5 向日葵列当对向日葵根部总酚和木质素含量的影响

2．2．6 向日葵根系分泌物的活性分析

2．3 讨论

2．4 小结

3 向日葵列当的侵染对不同抗性向日葵品种蛋白表达的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 试验设计

3．1．2 植物材料与生长条件

3．1．3 植物蛋白提取

3．1．4 植物蛋白定量

3．1．5 蛋白酶切及iTRAQ试剂标记

3．1．6 第一维高pH-RP液相分离

3．1．7 第二维反相液质联用RPLC-MS

3．1．8 参数设置

3．1．9 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 蛋白质丰度的定量分析

3．2．2 差异蛋白的功能分类

3．2．3 差异表达蛋白的功能网络

3．2．4 向日葵列当对不同品种向日葵中防御相关蛋白的影响

3．2．5 向日葵列当的寄生对感性品种TK0409中植物生长调节剂相关蛋白的作用

3．3 讨论

3．3．1 向目葵列当寄生的作用模式研究

3．3．2 向日葵对列当抗性的分子机理

3．3．3 感性互作过程中的蛋白质表达模式

3．4 小结

4 水杨酸预处理对向日葵列当寄生的缓解作用

4．1 材料与方法

4．1．1 试验设计

4．1．2 植物材料与生长条件

4．1．3 MDA含量和ROS水平的测定

4．1．4 抗氧化酶活性测定

4．1．5 谷胱甘肽含量测定

4．1．6 总酚与木质素含量的测定

4．1．7 内源水杨酸含量测定

4．1．8 基因表达量分析

4．1．9 数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 向日葵列当和水杨酸对植株生长的影响

4．2．2 向日葵列当和水杨酸对植株ROS和MDA的影响

4．2．3 向日葵列当和水杨酸对植株抗氧化酶活性的影响

4．2．4 向日葵列当和水杨酸对植株GSH含量以及GSH／GSSG的影响

4．2．5 向日葵列当和水杨酸对植株总酚和木质素含量的影响

4．2．6 向日葵列当和水杨酸对植株内源水杨酸含量的影响

4．2．7 向日葵列当和水杨酸对植株抗性相关基因表达量的影响

4．3 讨论

4．4 小结

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

5．2．1 萌发刺激物的鉴定与比较

5．2．2 向日葵列当中效应子的鉴定

参考文献

博士期间的主要成果