炎症状态下Neuropilin-1+诱导性调节T细胞的功能和稳定性研究

摘要

目的:
　　本课题研究Nrp-1和Helios在tTreg，pTreg和iTreg细胞表达的差异，通过体内体外实验观察Nrp-1+iTreg细胞的功能和稳定性，尤其在炎症状态下Nrp-1+iTreg细胞的免疫调节作用和稳定性，并探讨其发挥免疫抑制作用和维持免疫稳态的机制。
　　方法:
　　1.流式细胞术(FCM)法检测B6 Foxp3GFP小鼠脾脏CD4、CD8、CD19、CD11c、NK1.1、CD11b阳性细胞Nrp-1和Helios的表达水平。以及检测小鼠胸腺、淋巴结、脾脏和外周血细胞CD4+Foxp3+T细胞和CD4+Foxp3-T细胞Nrp-1和Helios的表达水平。
　　2.构建骨髓移植模型，FCM法检测移植8周后淋巴结、脾脏和外周血CD4+Foxp3+T细胞和CD4+Foxp3-T细胞Nrp-1和Helios的表达水平。
　　3.在不同条件下体外培养获得Th0、Th1、Th2、Th17、CD4medT和iTreg细胞，检测各自Nrp-1和Helios的表达水平。
　　4.IL-2和TGF-β条件下体外培养iTreg细胞，检测第0、2、3、7和13天Nrp-1和Helios的表达水平。
　　5.体外诱导iTreg细胞，加入Smad3抑制剂(SIS3)、JNK抑制剂(JNKi)或Ⅰ型TGF-β受体(ALK5)抑制剂(ALK5i)或DMSO对照，比较不同抑制剂对iTreg细胞Nrp-1和Helios表达的影响。
　　6.体外分选出Nrp-1+iTreg和Nrp-1-iTreg细胞，体外直接培养后第4和7天检测Foxp3GFP、IFN-γ和IL-17A表达水平;或经尾静脉输注到B6Rag1-/-小鼠，第4、7和12天后检测Foxp3GFP、IFN-γ和IL-17A表达水平。
　　7.Nrp-1+iTreg、Nrp-1-iTreg和Nrp-1Toxp3-CD4+T细胞抑制CD4+CD25-T细胞增殖的差异比较。
　　8.采用B6 Rag1-/-小鼠，腹腔注射CD4+CD25-CD45RBhi T细胞，诱导T细胞介导肠炎模型。分为5组，CD4+CD25-CD45RBhiT细胞，CD4+CD25-CD45RBhi T细胞+Nrp-1+iTreg， CD4+CD25-CD45RBhiT细胞+Nrp-1-iTreg细胞，CD4+CD25-CD45RBhiT细胞+Nrp-1+Foxp3-CD4+T，CD4+CD25-CD45RBhiT细胞+Nrp-1-Foxp3-CD4+T，观察小鼠体重变化、肠道病理，肠系膜淋巴结细胞IFN-γ，IL-17A和Foxp3表达水平。
　　9.体外诱导得到小鼠CD4+iTreg细胞，检测Nrp-1+iTreg和Nrp-1-iTreg细胞IL-10和IL-10R表达水平。进一步分选出Nrp-1+iTreg和Nrp-1-iTreg体外培养静息培养4天，然后再刺激50小时，以及不同细胞因子IL-2或IL-27条件下，检测IL-10和IL-10R表达水平。
　　实验结果:
　　1.FCM结果显示，小鼠脾脏CD4+T、DC和NK细胞显著表达Nrp-1，而Helios主要在CD4+T细胞表达;Nrp-1和Helios在胸腺CD4+Foxp3+T细胞(tTreg)都表达，Nrp-1表达水平低于Helios，然而Helios在胸腺CD4+Foxp3-T细胞也有较高的表达。另外，Nrp-1和Helios在淋巴结、脾脏和外周血CD4+Foxp3+T细胞表达，但Nrp-1表达水平高于Helios。
　　2.骨髓移植重建模型结果显示，8周后分离得到淋巴结、脾脏和外周血，CD4+Foxp3+T细胞(pTreg)显著表达Nrp-1和Helios。
　　3.IL-2和TGF-β体外培养的iTreg细胞Nrp-1和Helios表达明显升高，尤其在CD4+Foxp3+iTreg细胞，Nrp-1在CD4medT细胞（IL-2，无TGF-β条件下）低表达，Helios在CD4medT细胞有一定的表达。Th0、Th1、Th2和Th17细胞Nrp-1和Helios低表达。
　　4.体外培养的iTreg细胞第3-13天Nrp-1明显升高，Nrp-1+/Foxp3+达70％左右; Helios表达水平在第3天达高峰，之后表达下降。
　　5.体外培养的iTreg细胞表达Nrp-1和Helios依赖于TGF-β信号(ALK5i)，不依赖于Smad3和JNK信号通路。
　　6.体外稳定性实验显示，Nrp-1+iTreg和Nrp-1-iTreg体外培养第4和7天，Nrp-1+iTreg细胞Foxp3GFP表达水平高于Nrp-1-iTreg细胞，而IFN-γ表达水平低于Nrp-1-iTreg细胞。体内稳定性实验显示，细胞输注后第4、7和12天Nrp-1+iTreg细胞Foxp3GFP表达水平高于Nrp-1-iTreg细胞，而第7和12天IFN-γ和IL-17A表达水平低于Nrp-1-iTreg细胞。
　　7.体外抑制实验显示，Nrp-1+iTreg和Nrp-1-iTreg细胞都能抑制CD4+CD25-T细胞增殖，Nrp-1+iTreg的抑制作用优于Nrp-1-iTreg细胞，而Nrp-1-Foxp3-CD4+T细胞没有抑制功能。
　　8.体内抑制实验显示，Nrp-1+iTreg，Nrp-1-iTreg，Nrp-1+Foxp3-CD4+T和Nrp-1-Foxp3-CD4+T细胞分别与CD4+CD25-CD45RBhiT细胞一同转移至Rag1-/-小鼠，后两群Foxp3-CD4+T细胞不能抑制肠炎;而前两群iTreg细胞都能抑制肠炎，减缓体重下降，减轻肠道炎症，抑制Th1和Th17细胞，Nrp-1+iTreg的抑制功能优于Nrp-1-iTreg细胞。进一步检测发现，Nrp-1+iTreg来源细胞Foxp3表达高于Nrp-1-iTreg，IFN-γ和IL-17A表达水平低于Nrp-1-iTreg细胞，提示Nrp-1+iTreg在炎症状态下具有更强的免疫抑制功能和更好的稳定性。
　　9.体外实验显示，Nrp-1+iTreg细胞IL-10和IL-10R表达水平高于Nrp-1-iTreg。静息培养4天后再刺激，无细胞因子或IL-2或IL-27条件下，Nrp-1+iTreg细胞IL-10和IL-10R表达水平都高于Nrp-1-iTreg细胞。
　　结论:
　　1.Nrp-1在正常小鼠胸腺和外周淋巴器官Foxp3+CD4+T细胞高表达，也在造血干细胞来源的外周Treg细胞(pTreg)和体外诱导Treg细胞(iTreg)高表达，而在其他效应细胞Th1/Th2/Th17低表达，提示Nrp-1不仅在tTreg和pTreg细胞表达升高，还是iTreg细胞表面标志;Helios虽然在tTreg细胞、pTreg和iTreg表达较高水平，但Helios在胸腺CD4+Foxp3-T细胞和体外激活的CD4+Foxp3-T细胞（IL-2，无TGF-β条件下培养CD4medT细胞）表达，提示Helios特异性不高，不能作为tTreg和iTreg细胞的标志。
　　2.在非炎症状态下，体内和体外实验证实Nrp-1+iTreg细胞抑制功能和稳定性优于Nrp-1-iTreg细胞;在炎症状态下，Nrp-1+iTreg细胞仍具有抑制功能和稳定性，优于Nrp-1-iTreg细胞，其机制可能与Nrp-1+iTreg细胞高表达IL-10和IL-10R，维持Foxp3的表达，向Th1和Th17细胞分化抵抗有关。
　　3.我们鉴定了一群具有免疫抑制功能和高稳定性的Nrp-1+iTreg细胞，容易体外培养和获取，为临床提供大量Nrp-1+iTreg细胞，不像tTreg和pTreg细胞因数量少而限制应用。这些发现为临床应用诱导型Nrp-1+iTreg细胞治疗自身免疫炎症性疾病奠定了理论基础。

目录

声明

致谢

序言

摘要

缩略词表

1 引言

2 实验材料

2．1 实验动物

2．2 主要实验试剂

2．3 溶液配制

2．4 主要仪器设备

3 实验方法

3．1 小鼠脾脏、淋巴结、外周血和胸腺细胞的获取

3．2 小鼠脾脏、淋巴结、外周血和胸腺细胞Nrp-1和Helios的表达

3．3 B6 Rag1-/-小鼠骨髓移植模型

3．4 小鼠na（i）ve CD4+T细胞的分离

3．5 iTreg细胞的体外诱导和鉴定

3．6 体外流式分选小鼠Nrp-1+iTreg细胞

3．7 小鼠Nrp-1+iTreg细胞在非炎症状态下的稳定性研究(体外和体内实验)

3．8 小鼠Nrp-1+iTreg细胞的功能研究(体外实验)

3．9 小鼠Nrp-1+iTreg细胞的功能研究(体内实验)

3．10 小鼠Nrp-1+iTreg细胞IL-10和IL-10R表达研究

3．11 统计处理

4 实验结果

4．1 小鼠免疫细胞Nrp-1和Helio表达水平

4．2 小鼠中枢和外周Treg细胞Nrp-1和Helios的表达水平

4．3 小鼠骨髓移植重建模型外周Treg细胞Nrp-1和Helios的表达水平

4．4 体外培养的iTreg细胞Nrp-1和Helios表达明显升高

4．5 体外培养的iTreg细胞Nrp-1表达水平的动态变化

4．6 体外培养的iTreg细胞表达Nrp-1和Helios依赖于TGF-β信号

4．7 Nrp-1+iTreg细胞的体外和体内稳定性实验

4．8 Nrp-1+iTreg细胞的体外功能实验

4．9 Nrp-1+iTreg细胞的体内功能实验

4．10 Nrp-1+iTreg细胞IL-10和IL-10R表达水平

5 讨论

6 结论

7 附图

参考文献

综述

作者简历及在学期间所取得的科研成果