葡萄科药用植物三叶崖爬藤的亲缘地理学和分子鉴定研究

摘要

三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）隶属于葡萄科(Vitaceae)崖爬藤属（Tetrastigma Planch.），是中国特有的民间药用植物，俗称“三叶青”。该物种广泛分布于中国大陆的亚热带地区，在南部热带和亚热带岛屿（海南岛、台湾）也有少量分布，是中国亚热带常绿阔叶林下的典型广布成分。常绿阔叶林为中国亚热带低海拔地区的典型植被类型，它起源古老，自晚第三纪以来经历了复杂的植被变迁历史。古植被重建研究认为这一植被类型在末次盛冰期时完全退居至南部热带地区，全新世气温回暖后从南部避难所向北回迁;而有限的亲缘地理学研究案例则一致揭示了物种在冰期原地居留在多个避难所，冰后期仅存在有限的扩张。因此，中国亚热带常绿阔叶林及其组成物种对历史气候变化的响应模式目前仍不甚清楚，亟需选择该森林植被的典型的广布成分，并整合多学科的研究手段进行深入研究。本研究以常绿阔叶林下的重要藤本类型三叶崖爬藤为研究对象，在广泛的野外资源调查和取样的基础上，结合亲缘地理、系统发育、生物地理以及生态位模型的理论和方法，系统探讨了第三纪以来中国亚热带常绿阔叶林物种在不同时空尺度下的谱系分化、群体动态历史和遗传变异的空间分布格局，并利用分子鉴定技术开发了物种特异性SCAR分子标记，为三叶崖爬藤药材的科学鉴定提供技术支持。本研究获得的主要研究结果如下:
　　(1)基于叶绿体序列的种内谱系分化和群体动态历史
　　基于三个cpDNA片段（petL-psbE，trnK-matK，rbcL），对三叶崖爬藤的20个群体进行序列变异分析，共检测到20个叶绿体单倍型。在物种水平，三叶崖爬藤具有较高的叶绿体遗传多样性（hT=0.918;πT=2.110×10-3）和显著的谱系地理结构(NST=0.851，GST=0.795，P＜0.05)。系统发育分析和TCS构建的单倍型谱系关系均支持三叶崖爬藤种内存在两大地理谱系:西南谱系(SW)谱系和中东部谱系(CSE)。CSE谱系可进一步划分为海南岛、中国中部和东南部三大分支。对上述四个地理分支（中国西南，中部，东南部，海南）进行分层次的AMOVA分析揭示:67.9％的变异存在于地区间，19.5％存在于地区内群体间。基于cpDNA序列和多化石点校正的BEAST分歧时间估算结果表明，SW谱系和CSE谱系在上新世早期(c.5.07 Ma)开始分化。CSE谱系内部三个主要分支的分化时间均在上新世晚期，其中，海南岛分支最早分化(c.2.78 Ma)，中国中部和东南部两大分支的分化时间较晚(c.2.12 Ma)。基于叶绿体数据的祖先分布区重建结果揭示了，上新世早期的全球变冷和地质变化引发的地理隔离事件导致了三叶崖爬藤祖先群体压缩到中国西南部和南部两个避难所，进而分化形成两个独立的地理谱系，西南地区群体长期居留原地，而中国南部群体在上新世晚期到更新世早期经历了两次独立的由南向北的拓殖事件。失配分析结果也证实了SW谱系具有相对稳定的群体历史，仅在CSE谱系及其中部分支检测到了群体扩张信号，扩张事件发生在更新世早期到中期(CSE.0.81 Ma;中部分支:0.71 Ma)。上述研究结果揭示了第四纪前的东亚的环境变化对亚热带常绿阔叶林物种遗传结构的长期影响。
　　(2)微卫星水平的群体遗传结构和地区间基因流
　　本研究基于双重抑制法发开了8对有多态性的三叶崖爬藤特异性微卫星引物。基于微卫星数据的STRUCTURE聚类分析结果表明，三叶崖爬藤群体可以划分为四个地理分组，分别对应于中国西南部、中部、东部和南部地区（包括海南），这一模式反映了更新世后期该物种被压缩到至少四个独立的避难所。基于MIGRATE的地区间基因流检测结果表明，叶绿体地理分支（西南部、中部、海南、东南部群体）间存在中等或较低水平的基因流;个别地区间，如海南和东南部大陆群体间，存在明显的不对称基因流。生态位模型的模拟结果显示，末次盛冰期时三叶崖爬藤的适宜分布区向西南方向有一定的迁移，但是并没有完全退缩到南部热带地区，南部大陆地区保留了稳定的适宜生境并进一步扩展到南海大陆架区域，因此更新世冰期路桥的形成很可能为海南岛和大陆群体间的二次接触提供了迁移通道。这些研究结果反映了物种在末次冰期-间冰期循环中相对稳定的群体历史，对前期古植被重建提出的“中国亚热带常绿阔叶林在末次盛冰期完全退居至中国南部热带地区”的观点提出了挑战。
　　(3)比较转录组和单拷贝核基因开发
　　通过Hiseq2000测序平台对三叶崖爬藤CSE谱系和SW谱系个体进行转录组测序，运用de novo从头组装的方法，分别获得了52，838和65，197条unigenes，其中89％以上的unigene可以比对到公共蛋白库中。基于序列相似性，我们共找出6692对谱系间直系同源基因，其中有10对基因的Ka/Ks值显著大于0.5，可能经历了较强的正向选择或松散的净化选择，有3734对基因的Ka/Ks比值显著小于0.5，表明受到了强烈的净化选择作用。从谱系间的直系同源基因中我们共定位了286个EST-SSR位点，有78个位点在谱系间可能存在长度多态性。基于三种生物信息学手段，我们共鉴定了1018个单拷贝核基因位点，约78％的位点在谱系间存在中等或高水平的遗传分化(Pairwise identity≤99.5％)。通过与葡萄基因组比对预测内含子-外显子边界，本研究成功开发了12对外显子锚定的核基因引物，其中8对在叶绿体单倍型个体间具有较高的多态性（hT:0.909-0.993;πT:7.32-16.01×10-3），为后续基于多位点的统计亲缘地理学和景观遗传学研究提供了有效的功能基因标记。
　　(4)三叶崖爬藤（三叶青）的分子鉴定
　　本研究从100对ISSR通用引物中筛选了12条多态性适中、条带清晰和重复性好的引物，发现引物UBC843的扩增结果中在1800bp左右出现的条带为三叶崖爬藤样品所特有的，而崖爬藤属其他近缘种和伪品土(圜)儿均不存在此条带。经实验验证，针对此特异性条带设计的SCAR分子标记，只在三叶崖爬藤样品中才能扩增出单一、清晰的目标长度条带。因此在实际应用中，可根据扩增产物的有无和片段大小将三叶崖爬藤与同属近缘种和市场伪品进行准确区分。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 亲缘地理学

1．1．1 亲缘地理学简介

1．1．2 亲缘地理学相关理论

1．1．3 亲缘地理学研究方法

1．1．4 第二代测序技术及其在亲缘地理学研究中的应用

1．2 中国亚热带常绿阔叶林概述和相关研究进展

1．2．1 中国亚热带常绿阔叶林的分布和气候特征

1．2．2 中国亚热带常绿阔叶林的起源和发展

1．2．3 中国亚热带常绿阔叶林应对第四纪气候变化的两种假说

1．3 海南岛的形成历史及相关生物地理学研究进展

1．3．1 海南岛的起源和形成历史

1．3．2 海南岛和邻近大陆间断分布类群的生物地理学研究进展

1．4 中药鉴定技术概况与研究进展

1．4．1 分子鉴定技术

1．4．2 化学鉴定技术

1．4．3 性状显微鉴定技术

1．4．4 生物效应鉴定技术

1．5 三叶崖爬藤概况和相关研究现状

1．5．1 物种概况

1．5．2 化学成分和药理活性研究

1．5．3 种质鉴定和资源评价研究

1．5．4 群体遗传学研究

1．5．5 崖爬藤属分类和分子系统学研究

1．6 存在的问题

1．7 本研究的内容和目的

1．7．1 研究内容

1．7．2 研究目的和意义

第二章 野生资源调查及样品收集

2．1 三叶崖爬藤的野外调查和取样

2．1．1 标本和文献查阅

2．1．2 样品采集方法

2．2 野生三叶崖爬藤资源调查总结

2．2．1 资源概况

2．2．2 种内形态变异

第三章 基于叶绿体序列的亲缘地理学研究

3．1 材料

3．2 方法

3．2．1 基因组总DNA的提取

3．2．2 叶绿体片段筛选、扩增和测序

3．2．3 群体遗传与谱系地理结构分析

3．2．4 单倍型系统发育关系和分歧时间估算

3．2．5 祖先分布区重建

3．3 结果

3．3．1 群体遗传多样性

3．3．2 单倍型谱系关系

3．3．3 群体遗传结构分析

3．3．4 种内分歧时间估算

3．3．5 群体动态历史分析和祖先分布区重建

3．4 讨论

3．4．1 遗传多样性和遗传结构

3．4．2 种内谱系分化

3．4．3 群体动态历史

第四章 基于核微卫星标记的群体遗传学分析

4．1 三叶崖爬藤微卫星引物的开发

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．1．3 结果

4．1．4 结论

4．2 基于微卫星标记的三叶崖爬藤群体遗传多样性和遗传结构分析

4．2．1 材料

4．2．2 方法

4．2．3 结果

4．2．4 讨论

第五章 比较转录组分析和单拷贝核基因开发

5．1 材料

5．2 方法

5．2．1 总RNA提取

5．2．2 Illumina转录组测序和序列拼接

5．2．3 基因功能注释和CDS预测

5．2．4 直系同源基因的鉴定和碱基替换率的估算

5．2．5 EST-SSR分析

5．2．6 单拷贝核基因的开发和验证

5．3 结果

5．3．1 转录组测序质量和组装结果

5．3．2 Unigene功能注释

5．3．3 谱系间直系同源基因预测和碱基替换速率估算

5．3．4 EST-SSR位点信息分析

5．3．5 单挎贝棱基因的鉴定和验证

5．3．5 核倍型谱系关系和IMA分析

5．4 讨论

第六章 基于SCAR标记的三叶崖爬藤分子鉴定研究

6．1 材料

6．2 方法

6．2．1 基因组总DNA提取

6．2．2 ISSR引物筛选及扩增

6．2．3 ISSR特异片段的回收、克隆和测序

6．2．4 引物设计与SCAR-PCR检测

6．3 结果

6．3．1 ISSR特异性条带的发现

6．3．2 SCAR分子标记的转化

6．3．3 SCAR分子标记的检测

6．4 讨论

6．4．1 三叶崖爬藤SCAR分子标记的扩增结果

6．4．2 SCAR分子标记在药材鉴定中的优势

第七章 结论和展望

7．1 结论

7．1．1 三叶崖爬藤种内谱系分化和遗传多样性分布格局

7．1．2 三叶崖爬藤比较转录组研究和单拷贝核基因开发

7．1．3 三叶崖爬藤分子鉴定技术研究

7．2 展望

参考文献

在读期间主要成果

致谢