多梳家族蛋白PHC1在人多能干细胞基因组稳定性中的作用研究

摘要

背景：再生医学界领袖之一Richard.GOSS将再生、生命、死亡三者之间的关系解释为:“如果没有再生，就没有生命，如果处处再生，就没有死亡”，可见再生是个体存活维持组织功能的重要机制。基于人干细胞尤其是人多能干细胞(humanpluripotent stem cells，hPSCs)含人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)和人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的再生医学为发展个体化医疗带来了前所未有机遇和前景。hPSCs具有在体外无限复制和向各种谱系细胞分化的潜能，为治疗多个系统的退行性病变提供可能的种子细胞用于移植。但是hPSCs应用于临床还存在很多瓶颈，例如研究表明体细胞重编程过程中过表达重编程因子后引起的DNA复制压力和氧化自由基应激导致的DNA损伤可以破坏iPSCs的基因组产生基因突变，另一方面hPSCs在快速增殖过程中伴随着由细胞代谢和DNA复制活跃产生的活性氧自由基(ROS)也可以导致DNA损伤从而产生基因突变，移植携带基因突变的细胞到体内后可能产生肿瘤。因此研究hPSCs如何维持基因组的稳定性对于获得更安全的hPSCs用于细胞治疗十分重要。相比于体细胞DNA损伤修复的研究，关于hESCs和iPSCs如何维持基因组稳定性的报道却不多，目前的研究发现hPSCs维持基因组稳定性的主要机制为:一.ESCs内线粒体数量较低，同时ESCs主要通过不依赖于线粒体氧化磷酸化的糖酵解代谢方式获得能量，因此产生的ROS水平很低，另外ESCs高表达抗氧化相关基因，因此具备更强的抗ROS导致的DNA损伤能力;二.ESCs在DNA损伤时会发生分化和凋亡清除无法完成损伤DNA修复的细胞群体。本课题研究了多梳家族蛋白PHC1在hESCs基因组稳定性维持中的作用。我们的研究结果显示利用shRNA沉默PHC1的表达后可以降低NANOG的表达水平，提示PHC1可能参与hESCs的干性维持;进一步通过紫外辐射和阿霉素处理诱导DNA损伤后，敲降PHC1后的hESCs对DNA损伤更敏感。另外，以前的研究表明过表达重编程因子引起的DNA损伤反应是体细胞重编程的一个重要障碍。我们的结果显示在人体细胞重编程过程中敲降PHC1的表达后引起细胞凋亡增加、周期阻滞，从而降低重编程的效率，提示PHC1参与了多能性形成过程中细胞的DNA损伤反应。
　　第一部分、PHC1在hESCs干性维持中的作用
　　目的:研究PHC1对于多能性维持的作用。
　　方法:利用qPCR和western blot检测PHC1在hPSCs与分化细胞中的表达差异，构建PHC1 shRNA在hESCs中沉默PHC1基因表达后检测多能性基因的表达变化。
　　结果:PHC1在hPSCs中的表达高度富集。成功构建了在HFF和hESCs中有良好敲降效果的PHC1 shRNA。hESCs中沉默PHC1基因表达后多能性基因OCT4和NANOG在转录水平没有明显差异，但NANOG蛋白水平表达有一定降低。
　　结论:PHC1对于hESCs多能性维持具有一定的作用。
　　第二部分、PHC1对于维持hESCs基因组稳定性的作用
　　目的:建立诱导hESCs DNA损伤的模型，探索敲降PHC1后hESCs对DNA损伤修复的反应。
　　方法:沉默PHC1基因表达后，分别采用紫外(UV)辐射，阿霉素(Dox)处理诱导hESCs DNA损伤模型，检测细胞凋亡水平变化细胞增殖情况。
　　结果:对比载体对照组，敲降PHC1可以造成hESCs基因组稳定性下降，对DNA损伤敏感度增加。
　　结论:PHC1对hESCs基因组稳定性维持具有一定作用。
　　第三部分、PHC1在人体细胞重编程中的作用
　　目的:探讨PHC1在过表达转录因子介导的体细胞重编程中的作用。
　　方法:建立利用慢病毒载体过表达OCT4，SOX2，KLF4，c-MYC重编程人成纤维细胞为iPSCs的体系，检测沉默PHC1表达后对重编程效率的影响。
　　结果:重编程过程中沉默PHC1后引起细胞周期阻滞、细胞凋亡增加以及重编程效率降低。
　　结论:PHC1参与人体细胞重编程过程中发生的DNA损伤反应，从而影响重编程效率。

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声明

致谢

摘要

缩略词

绪论

第一部分 PHC1在hESCs干性维持中的作用

1．1 实验试剂和仪器

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

第二部分 PHC1对于维持hESCs基因组稳定性的作用

2．1 实验试剂和材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

第三部分 PHC1在人体细胞重编程中的作用

3．1 实验试剂和仪器

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

4 总结

参考文献

综述

作者简介及在读期间所取得的科研成果