糖脂聚合物修饰纳米结构脂质载体药物递释系统的抗内异疼痛研究

摘要

疼痛是子宫内膜异位症的主要临床表现症状，主要采用激素和手术治疗。激素疗法副作用大，疗效不确切，手术治疗易复发，因此，探索药物治疗的新方法是内异疼痛新疗法发展的重要方向。ATP及其P2X3受体可能在内异症疼痛敏化及信息传递中发挥了重要作用，A-317491是P2X3选择性受体拮抗剂，可抑制ATP激活P2X3受体引起的Ca2+内流，抑制动作电位产生，抑制疼痛。Ca2+内流是衡量疼痛的重要指标。A-317491作用于P2X3受体高表达的内异病灶，一般情况下，药物很难分布到该作用位点，药物疗效差。本研究旨在构建递释A-317491的纳米给药系统，通过给药系统在P2X3受体高表达部位的聚集，实现内异疼痛的有效治疗。
　　A-317491为难溶性药物，采用纳米结构脂质载体(Nanostructured lipid carriers，NLC)可实现对药物的有效包封，但NLC存在针对内异病灶P2X3高表达部位的有效分布问题。本课题组前期研究显示，糖脂聚合物胶束(Stearic acid-g-chitosanoligosaccharide，CSOSA)在大鼠异位内膜组织有较好分布。因此，采用CSOSA修饰的NLC给药，有可能实现A-317491的内异疼痛有效治疗。
　　本研究构建了含20wt％液态油酸的NLC，包封A-317491(NLC/A-317491)。采用CSOSA嫁接物修饰NLC/A-317491，制备CSOSA/NLC/A-317491纳米粒，提高其异位内膜组织的分布。经CSOSA修饰，CSOSA/NLC纳米粒荷正电。采用CSOSA∶NLC=2∶1(w/w)的CSOSA修饰NLC，CSO SA/NLC/A-317491纳米粒的粒径为48.1±5.2nm，表面电位为28.3±0.4mV。透射电镜观察纳米粒呈类球形，分布较均一。CSOSA/NLC/A-317491纳米粒的包封率和载药量分别为64.4±2.6％和2.10±0.1％。CSOSA/NLC/A-317491与NLC/A-317491纳米粒72h药物的累计释放百分率分别为58.8±1.57％和39.0±2.22％，CSOSA/NLC/A-317491的释放速率明显快于NLC/A-317491。
　　以高表达P2X3受体的鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)为模型细胞，细胞摄取实验结果表明，CSOSA/NLC纳米粒可有效被PC12细胞摄取。以fluo-4AM为Ca2+荧光染料，考察CSOSA/NLC/A-317491纳米粒对Ca2+内流的抑制作用，结果显示，CSOSA/NLC/A-317491纳米粒孵育12h，可有效抑制ATP激活P2X3受体引起的Ca2+内流，与A-317491钠盐水合物效果相当，载药纳米粒可维持更长的作用时间。
　　近红外成像结果显示，CSOSA修饰的NLC纳米粒可明显提高NLC的裸鼠异位内膜组织分布。疼痛生物行为学结果表明，CSOSA/NLC/A-317491可减弱模型大鼠机械和热痛觉敏感，并维持较长时间，且不影响正常大鼠的疼痛生物行为。给药24h，CSOSA/NLC/A-317491可显著降低模型大鼠DRG(Dorsal root ganglion,DRG)组织P2X3和神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）蛋白表达，明显减弱内异大鼠的疼痛敏化。
　　CSOSA/NLC/A-317491纳米粒是一种潜在的治疗内异疼痛的纳米给药系统。

目录

声明

致谢

摘要

引言

第一章 壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成及理化性质研究

1．1 仪器与试剂

1．2 实验方法

1．2．1 壳聚糖硬脂酸嫁接物合成

1．2．2 壳聚糖硬脂酸嫁接物结构确证

1．2．3 嫁接物氨基取代度测定

1．2．4 嫁接物临界胶束浓度测定

1．2．5 嫁接物胶束的粒径及表面电位测定

1．3 结果与讨论

1．3．1 嫁接物的合成及结构确证

1．3．2 嫁接物氨基取代度

1．3．3 嫁接物临界胶束浓度

1．3．4 粒径及表面电位

1．4 本章小结

第二章 糖脂聚合物修饰纳米结构脂质载体给药系统的制备及理化性质研究

2．1 仪器与试剂

2．1．2 试剂

2．2 实验方法

2．2．1 纳米结构脂质载体给药系统制备

2．2．2 糖脂聚合物修饰纳米结构脂质载体给药系统的制备

2．2．3 磁性氧化铁标记纳米结构脂质载体的制备

2．2．4 粒径与表面电位测定

2．2．5 透射电子显微镜观察

2．2．6 A-317491含量测定

2．2．8 CSOSA／NLC／A-317491纳米粒的载药量与包封率测定

2．2．9 载药纳米粒的体外药物释放动力学

2．3 结果与讨论

2．3．1 粒径与表面电位

2．3．2 A-317491含量测定

2．3．3 载药纳米粒的载药量与包封率

2．3．4 载药纳米粒的体外药物释放动力学

2．4 本章小结

第三章 糖脂聚合物修饰纳米结构脂质载体药物递释系统的细胞药效学研究

3．1 仪器与试剂

3．1．1 仪器

3．1．2 试剂

3．2 实验方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 CSOSA／NLC纳米粒的细胞摄取

3．2．3 CSOSA／NLC纳米粒体外安全性评价

3．2．4 载药纳米粒细胞药效学评价

3．3 结果与讨论

3．3．1 CSOSA／NLC纳米粒的细胞摄取

3．3．2 CSOSA／NLC纳米粒体外安全性评价

3．3．3 CSOSA／NLC／A-317491的细胞药效

3．4 本章小结

第四章 糖脂聚合物修饰纳米结构脂质载体药物递释系统的动物药效学研究

4．1 仪器与试剂

4．1．1 仪器

4．1．2 试剂

4．1．3 实验动物

4．2 实验方法

4．2．1 内异模型大鼠建立

4．2．2 CSOSA／NLC纳米粒的体内分布

4．2．3 内异模型大鼠疼痛生物行为学测定

4．2．4 子宫内膜及DRG组织的P2X3和NGF蛋白测定

4．3 结果与讨论

4．3．1 CSOSA／NLC纳米粒的内异裸鼠体内分布

4．3．2 CSOSA／NLC纳米粒内异模型大鼠的体内分布

4．3．3 内异模型大鼠疼痛生物行为学

4．3．4 内膜组织P2X3及NGF蛋白的测定

4．3．5 DRG组织P2X3及NGF蛋白的测定

4．4 本章小结

结论

参考文献

文献综述

作者简历