甲状腺癌分子致病机制及其临床应用价值的研究

摘要

研究背景:
　　甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，美国最新统计数据显示甲状腺癌正以每年6％的增长速度成为女性第五大恶性肿瘤，且在未来10年内将持续增长。其中甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer, PTC)和滤泡状癌(follicular thyroidcancer，FTC)最常见（约占90％）且生物学行为良好，统称为分化型甲状腺癌（differentiated thyroid cancer, DTC），临床予以根治性手术和TSH抑制治疗，并对肿瘤侵袭转移者进行I131放射治疗，十年生存率可达到90％以上。但是仍有一小部分患者早期出现进展转移、术后复发、对I131治疗不敏感、甚至死亡。因此，研究甲状腺癌分子致病机制、识别其发生发展和恶性转化相关的分子遗传学事件，将为临床早期诊断恶性程度较高、预后较差的病例提供分子标志物，并为治疗提供潜在的靶点。
　　甲状腺癌的发生发展过程伴随多种遗传学和表观遗传学改变，且不同的组织病理类型其分子致病机制也各不相同。例如，RET信号通路的异常激活是甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer，MTC)发生的主要原因，而BRAF突变激活的MAPK信号通路以及RAS、PTEN和PIK3CA突变激活的PI3K信号通路分别参与甲状腺乳头状癌和滤泡状癌的发生。研究证实，60％-70％的甲状腺癌存在至少一种分子遗传学改变，而这些分子遗传学改变可作为潜在的分子标志物，用于临床诊断、危险分级、疗效及预后预测。多项研究提示BRAFV600E突变与甲状腺乳头状癌高危的临床病理特征及不良预后密切相关，因此有研究者认为BRAFV600E突变是甲状腺乳头状癌最有价值的分子标志物之一。
　　近年来甲状腺癌分子致病机制的研究取得了重大进展，但是绝大部分研究集中于核基因组，而对独立于核基因组外的线粒体基因组研究甚少。线粒体是细胞内半自主的细胞器，参与能量代谢、细胞衰老和凋亡等重要活动。但是肿瘤细胞即使在有氧的条件下仍依赖糖酵解途径进行代谢供能，这可能与肿瘤细胞线粒体功能异常密切相关。线粒体基因组(mitochondrial DNA，mtDNA)是大小为16569bp的双链环形DNA分子，编码参与氧化磷酸化的13条多肽链、2条rRNA以及22条tRNA，另外还包含调控复制和转录的非编码D-loop区(displacement-loop region，D-loop region)。多种类型的肿瘤中普遍存在线粒体基因突变及基因组拷贝数改变，致病性线粒体突变可严重影响电子呼吸链(electron transport chain，ETC)的传递进而产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，ROS进一步活化肿瘤相关信号通路进而抑制肿瘤细胞凋亡、促进增殖和转移。但是，线粒体基因组在甲状腺癌发生发展中的作用及其临床意义尚不明确，现有研究主要集中于线粒体数量异常增多的嗜酸细胞亚型甲状腺癌或线粒体基因组的突变热点区域。
　　本课题通过线粒体全基因组测序全面研究甲状腺癌中线粒体基因突变、线粒体基因拷贝数、单体型和单核苷酸多态性位点等线粒体基因组的特征，筛选与甲状腺癌发病相关的潜在致病突变，分析线粒体基因组特征与患者临床病理特征和预后的相关性。另外，对细胞核基因组中最重要的分子遗传学事件BRAFV600E和TERT启动子突变的相关研究进行系统性回顾，整合汇总后评估BRAFV600E和TERT启动子突变在甲状腺癌临床诊断、危险分层及治疗中的应用价值。
　　第一部分:甲状腺乳头状癌中线粒体基因组特征的研究
　　背景:
　　近年来，甲状腺乳头状癌的分子致病机制研究取得了重大进展。但是，绝大部分研究集中于核基因组，而线粒体基因组在甲状腺乳头状癌中的特征及其临床意义尚不明确。本研究旨在明确线粒体基因突变、拷贝数、单体型以及单核苷酸多态位点等特征，筛选可能致病的突变位点，并进一步分析线粒体基因组特征与甲状腺癌患者临床病理特征及预后的相关性。
　　方法:
　　本研究对66例甲状腺乳头状癌组织及相应癌旁组织进行线粒体全基因组测序，并以16例甲状腺正常组织和376例正常人群外周血做对照。测序结果与线粒体Mitomap数据库进行比对，筛选线粒体基因组中发生改变的碱基位点。并进一步根据碱基位点的氨基酸保守性、在对照组织中的突变率以及生物信息学软件预测，筛选可能致病的突变位点。运用荧光定量PCR技术检测线粒体基因组拷贝数。
　　结果:
　　本研究共筛选出位于543个位点的2508个碱基改变，其中包括33个尚未报道过的新发突变。近一半(31/66)的甲状腺乳头状癌样本中存在杂合性碱基改变，其中在28例样本中发现分别存在于44个位点的52个体细胞突变。在蛋白质编码区，7个无义突变、11个框移突变以及15个生物信息学软件筛选出的非同义突变具有潜在的致病性。进一步联系患者临床病理特征发现，这33个潜在致病突变与患者的年龄(p=0.0176)及肿瘤较晚的分期(p=0.0218)密切相关，且致病性位点多为新发(p=0.0003)、杂合(p=0.0343)和体细胞突变(p=0.0018)。在近三分之二(46/66)的甲状腺乳头状癌组织中，线粒体基因拷贝数较对应癌旁组织增加，且肿瘤组织中拷贝数的平均值是癌旁组织的近4倍(p＜0.0001)。另外，单体型N的3种亚型（A4、B4a和B4g）和9个单核苷酸多态性位点(A16164G、C16266T、 G5460A、T6680C、G9123A、A14587G、T16362C和G709A)与甲状腺癌的发生相关。
　　结论:
　　本研究全面分析了线粒体基因组在甲状腺癌中的特征，并证实其在甲状腺癌临床病理特征和预后中的意义。该研究从线粒体基因组的角度初步探索甲状腺乳头状癌的分子致病机制，为临床实践提供了潜在的分子标志物和治疗靶点。
　　第二部分:BRAFV600E基因突变在甲状腺结节细针穿刺中诊断价值的研究
　　背景:
　　细针穿刺是甲状腺结节术前诊断的重要手段，然而约有10％-40％的结节无法通过细针穿刺的细胞病理学明确诊断。BRAFV600E突变是甲状腺癌最重要的分子遗传学事件之一，因此也是甲状腺细针穿刺非常具有前景的诊断标志物。本研究旨在评估BRAFV600E突变在甲状腺结节术前细针穿刺中的诊断价值，并着重研究探讨其在细针穿刺后细胞病理学无法确诊的病例中的意义。
　　方法:
　　系统检索PubMed、Web of Science、Scopus、Ovid、Elsevier以及CochraneLibrary等数据库中发表于2015年6月前的相关文献，最终共有88篇文献纳入本项研究。运用Meta-Disc软件整合各研究中的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、诊断比值比以及受试者工作特征曲线等诊断指标，以评估各诊断方法的应用价值。
　　结果:
　　研究结果显示BRAFV600E突变检测可将细针穿刺诊断的灵敏度从81.4％提高到87.4％，而假阴性率从8％降低到5.2％。在细胞病理学无法确诊的甲状腺结节中，BRAFV600E突变率为23％且在不同的亚型中各不相同（可疑恶性肿瘤为43.2％，意义不明确的细胞非典型病变或滤泡性病变为13.7％，滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤为4.43％）。在可疑恶性的甲状腺结节中，BRAFV600E突变检测的灵敏度较意义不明确的细胞非典型病变或滤泡性病变以及滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤的甲状腺结节高(59.4％ vs40.1％ vs19.5％)，而特异度则相反(86.1％ vs99.5％vs99.7％)。受试者工作特征曲线同样显示BRAFV600E突变在可疑恶性肿瘤和意义不明确的细胞非典型病变或滤泡性病变中的诊断价值较滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤中更高。
　　结论:
　　BRAFV600E突变检测能提高甲状腺结节细针穿刺的诊断效率，尤其对细针穿刺后细胞病理学无法明确诊断的甲状腺结节中的可疑恶性肿瘤具有较好的诊断效率，因此有利于提高术前恶性结节的检出率从而指导临床治疗方案的选择。
　　第三部分:TERT启动子突变与甲状腺癌临床病理特征及预后的相关性研究
　　背景:
　　TERT启动子突变是甲状腺癌的致病突变之一，近年来许多研究评估其在甲状腺癌临床病理特征和预后中的意义和临床应用价值，然而部分研究结果仍存在分歧。
　　方法:
　　系统性检索PubMed、Web of Science、Scopus、Ovid以及Cochran Library等数据库，获取2016年4月前发表的相关文献。运用R语言对突变率进行汇总，Stata软件获取比值比(OR)或标准化均数差(SMD)及其95％置信区间(95％ CI)。
　　结果:
　　本研究共纳入22项研究的4907例样本。分析结果显示，恶性程度较高的甲状腺癌组织病理类型中TERT启动子突变率较高（低分化甲状腺癌为33.37％、未分化癌为38.69％以及高细胞亚型甲状腺乳头状癌为30.23％）。进一步联系患者临床病理特征和预后发现，TERT启动子突变多存在于45岁以上患者和男性患者，并与较大的肿瘤直径、腺外侵犯、血管浸润、淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期以及疾病的复发迁延和患者死亡密切相关。TERT启动子突变（尤其C228T突变）多存在于BRAFV600E突变的甲状腺癌病例，且BRAFV600E与TERT启动子突变同时存在时肿瘤的恶性程度更高、侵袭性更强。
　　结论:
　　TERT启动子突变多存在于恶性程度较高的组织病理类型，并与甲状腺癌患者恶性临床病理特征、不良预后及BRAFV600E突变密切相关，因此可作为甲状腺癌特异性的分子标志物，用于早期诊断、危险分层、预后预测及治疗方案选择。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩写词表

前言

第一部分：甲状腺乳头状癌中线粒体基因组特征的研究

1．引言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第二部分：BRAFV600E突交在甲状腺细针穿刺中的应用价值研究

1．引言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第三部分：TERT启动子突变与甲状腺癌临床病理特征及预后的相关性研究

1．引言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

综述 线粒体在肿瘤发生发展中的分子致病机制及其临床应用价值

作者简历及在学期间所取得的科研成果