典型溴苯类阻燃剂甲状腺激素受体干扰效应分子机制研究

摘要

溴苯阻燃剂在聚苯乙烯树脂、纺织、涂料、合成橡胶、电子电器等产品中应用广泛，其残留在空气、水体和土壤等多种环境介质以及生物体中均被检测出。溴苯阻燃剂暴露导致的潜在毒性引起了广泛关注，然而目前关于溴苯阻燃剂的内分泌干扰效应研究相对较少，尤其是关于甲状腺激素受体(TR)干扰效应报道匮乏，其分子作用机制尚不明晰。本文选取六种新型溴苯阻燃剂(BTBPE，DBDPE，HBB，PBEB，pTBX，TBPhA)，采用双荧光素酶报告基因和人重组基因酵母双杂方法研究了其诱导的TR干扰效应，并从分子起始事件(MIE)角度出发，采用荧光光谱技术分析了溴苯阻燃剂与TRβ受体配体结合域(LBD)的分子交互作用，探讨了潜在的TR干扰效应分子机制。同时考察了CYP450酶介导的生物转化对六种溴苯阻燃剂TR拮抗效应的增毒/减毒效应，主要研究结果如下:
　　(1)采用双荧光素酶报告基因方法，利用转染了人甲状腺激素受体pGal4-L-TR质粒的CV-1细胞，评估了六种阻燃剂的TR干扰效应。六种阻燃剂在实验设置浓度梯度(1×10-10 M、1×10-9 M、1×10-8 M、1×10-7 M、1×10-6 M)下均无显著TR激动效应，但BTBPE，HBB和PBEB具有拮抗效应并呈显著剂量-效应关系，其对TR的最大拮抗率分别为60％，62％和66％。
　　(2)采用人肝微粒体(HLM)及人CYP3A4酶，研究了其对六种阻燃剂的生物转化并分析了其转化后TR拮抗效应的变化，发现BTBPE和PBEB具有代谢减毒现象。经HLM转化后BTBPE的TR拮抗率由22.69％降低至12.19％，经CYP3A4转化后BTBPE的TR拮抗率由22.69％降低至13.59％。经HLM转化后PBEB的TR拮抗率由27.68％降低至13.27％，经CYP3A4酶转化后PBEB的TR拮抗率由27.68％降低至14.64％。HBB经HLM和CYP3A4酶介导的生物转化后，其TR拮抗效应没有显著变化。CYP3A4酶是介导BTBPE和PBEB生物转化的主要酶之一，对该类物质的风险评价需全面考虑其生物转化导致的潜在影响。
　　(3)采用P450-GloTM CYP3A4(Luciferin-IPA)检测方法研究了BTBPE，HBB和PBEB对CYP3A4酶活性的影响，发现BTBPE，HBB和PBEB能够抑制CYP3A4酶活性并具有明显的剂量-效应关系。BTBPE，HBB和PBEB能够抑制CYP3A4酶活性，其半数抑制浓度（IC50）分别为0.33μM，0.52μM和0.65μM。以CYP3A4酶强抑制剂酮康唑为阳性对照，所测IC50为0.16μM，表明BTBPE，HBB和PBEB是CYP3A4酶的较强抑制剂，能够干扰CYP3A4酶介导的内源和外源性物质的正常代谢过程。
　　(4)采用稳态荧光光谱实验和荧光寿命实验研究了BTBPE，HBB和PBEB与TRβLBD蛋白的相互作用。三种新型溴苯阻燃剂能引起TRβ LBD蛋白的静态猝灭，与TRβLBD蛋白结合力大小依次为PBEB＞HBB＞BTBPE，与其TR拮抗效应强弱顺序一致，表明其与TRβ LBD分子交互作用可能是导致其TR拮抗效应的重要原因之一。三种阻燃剂主要通过静电作用和疏水作用等与TRβ LBD蛋白发生分子交互作用。
　　综上所述， BTBPE，HBB和PBEB具有显著的TR拮抗效应;三种阻燃剂主要通过静电作用和疏水作用与TRβ LBD蛋白相互作用，这可能是引起其TR拮抗效应的MIE事件。BTBPE和PBEB的TR拮抗效应经HLM或CYP3A4酶介导的生物转化后呈显著代谢减毒效应，这提示对该类阻燃剂的毒性风险评估需要充分考虑生物转化的影响因素。

目录

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论文说明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 新型溴苯阻燃剂

1．2．1 新型溴苯阻燃剂的产生与发展

1．2．2 新型溴苯阻燃剂的结构与理化性质

1．2．3 新型溴苯阻燃剂的环境残留

1．2．4 新型溴苯阻燃剂的毒性效应

1．3 甲状腺内分泌干扰效应

1．3．1 甲状腺内分泌干扰效应途径

1．3．2 甲状腺激素受体结构

1．3．3 P450酶生物转化介导的内分泌干扰效应

1．4 课题研究内容和意义

1．4．1 研究内容

1．4．2 课题研究意义

1．4．3 拟采取的研究方案

1．4．4 技术路线

参考文献

第二章 典型溴苯阻燃剂的甲状腺激素受体干扰效应

2．1 前言

2．2 实验材料和仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 细胞活力实验

2．3．3 双荧光素酶报告基因实验

2．3．4 重组基因酵母实验

2．3．5 CYP450生物转化介导的TR干扰效应检测

2．3．6 P450-GloTM CYP3A4酶活性检测

2．3．7 数据处理

2．4 结果与讨论

2．4．1 细胞活力实验

2．4．2 双荧光素酶报告基因实验

2．4．3 重组基因酵母实验

2．4．4 P450酶介导的生物转化对TR干扰效应的影响

2．4．5 P450-GloTM CYP3A4酶活性检测

2．5 本章小结

参考文献

第三章 典型溴苯阻燃剂与甲状腺激素受体配体结合域蛋白的相互作用

3．1 前言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 主要实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 TRβ LBD蛋白的表达

3．3．2 荧光光谱法

3．4 结果与讨论

3．4．1 稳态荧光实验

3．4．2 荧光猝灭模式分析

3．4．3 热力学参数计算

3．4．4 荧光寿命分析

3．5 本章小结

参考文献

第四章 结论与展望

主要研究结论

未来工作设想

硕士期间发表的论文