胰岛素样生长因子1受体抑制剂Linsitinib在食管鳞癌中的作用及耐药机制研究

摘要

食管癌是居全球死亡率第6的高度侵袭性恶性肿瘤。我国是食管癌高发的国家之一，接近70％的食管鳞癌病例发生在中国，其发病率和死亡率均居世界首位。当前食管鳞癌治疗是基于根治性切除术联合围手术期化疗或化放疗的模式，但是由于仍未发现确实有效的分子治疗靶点，其5年生存率仅为10％-25％。驱动基因指导下的分子靶向治疗是实现食管鳞癌精准治疗和改善患者预后的重要发展方向。
　　目前制约食管鳞癌精准研究的最大屏障是缺乏有效研究模型。迄今为止，食管鳞癌的可用商业化细胞株比较少，常用的食管癌细胞株主要来源于日本，包括KYSE系列和TE系列。这些细胞系长期在体外传代，为了适应体外培养的环境，一些已经丧失了原始肿瘤组织的特性。同时由于种族差异，生活习惯以及环境因素不同等因素，这些细胞能否代表我国食管癌的类型和特点存在很大的疑问。相比之下，来源于患者新鲜肿瘤组织的原代细胞株(PDC)因为较好的保存肿瘤的主要特征如组织学、基因组特征、细胞异质性和药物反应等特点，与商业化的肿瘤细胞株相比，更能模拟肿瘤在患者体内生长的真实情况，有望打破目前食管癌临床研究的瓶颈。
　　我们课题组利用2014年05月至2015年12月在浙江省肿瘤医院进行手术及胸水引流的原发食管鳞癌患者新鲜的肿瘤组织/胸水进行原代培养，通过组织块贴壁法以及胰酶消化法成功建立10株食管鳞癌的原代细胞株，并对其进行了包括染色体核型、STR分型检测、细胞增殖、肿瘤标记物检测、克隆形成以及裸鼠成瘤等实验，确定了所建食管鳞癌原代细胞的生物学特性。
　　我们进一步利用这些3-5代原代细胞株进行包括12种临床常用化疗药物和9种已开展临床试验的靶向药物的药物筛选。结果发现16株原代细胞中，25％(4/16)细胞对胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor1 receptor，IGF1R)酪氨酸激酶抑制剂Linsitinib敏感，而25％(4/16)细胞相对耐受。利用Linsitinib作用于6株食管鳞癌商业化细胞株Eca-109、EC-9706、KYSE-510、KYSE-410、TE-1及TE-13，发现TE-13对Linsitinib敏感，而其余5株则相对耐受。我们进一步利用Western Blot检测IGF1R的下游信号通路，发现Linsitinib通过抑制IGF1R下游PI3K/AKT/mTOR和Ras/MEK/ERK信号通路的激活发挥生物学效应。但在敏感株细胞中NF-κB p65活化受到抑制;而耐药株中p65活化得到增强，细胞凋亡受到抑制。在耐药株中将NF-κB的抑制剂JSH-23和Linsitinib合用，可以有效的增加耐药株对Linsitinib的敏感性。
　　综上所述，我们建立的食管鳞癌原代细胞株模型，建系时间较短，性状稳定，以这些食管癌细胞系作为研究模型，对于了解中国人的原发性食管癌发生机理有很大帮助。并且我们利用这些原代细胞株进行药物筛选发现Linsitinib可能是食管鳞癌潜在的靶向药物。NF-κB信号通路的活化的食管鳞癌对Linsitinib原发耐药，p65可能可以作为食管鳞癌Linsitinib疗效预测分子标志物。
　　第一部分食管鳞癌原代细胞株的建立
　　目的:
　　建立国人来源的食管鳞癌细胞的原代分离纯化及培养方法，为研究食管癌的生物学特性、癌变机理、药物筛选等提供必要的研究模型。
　　方法:
　　收集2014年05月至2015年12月在浙江省肿瘤医院手术切除的原发食管鳞癌患者新鲜的肿瘤组织及胸水，利用组织块贴壁法以及胰酶消化法建立食管鳞癌的原代细胞株10株。并对其通过形态观察、染色体核型、STR分型进行鉴定;利用实时无标记细胞功能分析仪测定细胞增殖;免疫组化检测肿瘤标记物cytokeratin5/6(CK5/6)，p63，cytokeratin14(CK14)，CgA，Sy，CD56在细胞株的表达;利用克隆形成以及裸鼠成瘤等实验检测所建原代细胞株的成瘤性。
　　结果:
　　成功建立可体外稳定传代的食管鳞癌原代细胞株10株(ZEC-014、ZEC-056、ZEC-134、ZEC-157、ZEC-166、ZEC-043、ZEC-061、ZEC-118、ZEC-127、ZEC-145)。镜下观察呈扁平不规则多边形，细胞彼此紧密相连，符合上皮样细胞的特点。STR测序结果与ATCC、DSMZ等细胞保存库的数据进行比对，显示10株食管鳞癌细胞株均为新建细胞株。染色体核型检测显示染色体数目大多分布在34～85之间。10株细胞株肿瘤标记物检测CK5/6、p63 CK14均为阳性，CgA、 Sy、CD56均为阴性。克隆形成实验提示接种密度为4500个细胞时的细胞克隆形成能力较强。10株细胞中ZEC-014、ZEC-056、ZEC-134、ZEC-157和ZEC-166可在裸鼠皮下成瘤，而ZEC-043，ZEC-061，ZEC-118，ZEC-127和ZEC-145成瘤能力较差。
　　结论:
　　我们成功确立了原代食管鳞癌细胞分离、纯化及培养的方法，建立了一系列食管鳞癌细胞株。所建立的细胞株具有各自的生物学特点，为今后食管癌的研究提供了研究工具。
　　第二部分胰岛素样生长因子1受体抑制剂Linsitinib在食管鳞癌中的作用
　　目的:
　　寻找可用于食管鳞癌的分子靶向药物，并探讨IGF1R抑制剂Linsitinib在食管鳞癌中的作用。
　　方法:
　　利用MTT实验检测12种临床常用化疗药物包括托泊替康(Topotecan)、伊立替康(Irinotecan)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、表柔比星(Epirubicin)、阿霉素(Doxorunicin)、吉西他滨(Gemcitabine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、紫杉醇(Paclitaxel)、卡培他滨(Capecitabine)、卡铂(Carboplatin)和顺铂(Cisplatin)，以及9种已开展临床试验的靶向药物包括Afatinib、 Bortezomib、Navitoclax、Sunitinib、Trametinib、Eriotinib、GDC-0941、MK-2206和Linsitinib对16株食管鳞癌原代细胞及6株商业化细胞(Eca-109/EC-9706/KYSE-510/KYSE-410/TE-1/TE-13)的增殖影响，选择食管鳞癌潜在的靶向药物。通过免疫印记实验检测Linsitinib抑制食管鳞癌增殖的机制。
　　结果:
　　MTT实验发现16株原代细胞中，25％(4/16)细胞对Linsitinib敏感，而25％(4/16)细胞相对耐受。食管鳞癌商业化细胞株中TE-13对Linsitinib敏感，而其余5株则相对耐受。免疫印记实验显示Linsitinib能够显著降低食管鳞癌细胞TE-1、TE-13和KYSE-510中pAKT308、pAKT473、p-mTOR以及p-ERK1/2的磷酸化水平。
　　结论:
　　Linsitinib通过抑制IGF1R下游PI3K/AKT/mTOR和Ras/MEK/ERK信号通路的激活发挥生物学效应，可能是食管鳞癌潜在的靶向药物
　　第三部分食管鳞癌对胰岛素样生长因子1受体抑制剂Linsitinib原发耐药的机制研究
　　目的:
　　Linsitinib是食管鳞癌潜在的小分子抑制剂，但是部分食管鳞癌患者对其原发耐受。目前，对于Linsitinib原发耐药的机制还是很清楚。本研究主要探讨食管鳞癌对Linsitinib耐药的机制。
　　方法:
　　利用western blot检测Linsitinib对食管鳞癌细胞TE-13、TE-1以及KYSE-510凋亡通路和NF-κB信号通路的影响。在食管鳞癌细胞上联用Linsitinib与NF-κB抑制剂JSH-23，观察细胞凋亡，细胞活力以及克隆形成的能力。
　　结果:
　　与对Linsitinib敏感的TE-13细胞相比，耐药株TE-1及KYSE-510的凋亡受到明显的抑制。通过对NF-κB信号通路的检测发现，敏感株细胞中p65活化受到抑制，同时p65下游的靶基因IL-6和IL-8的mRNA水平也显著下调，而耐药株则相反。在食管鳞癌细胞上联用Linsitinib与NF-κB抑制剂JSH-23，能够使得耐受的细胞对Linsitinib敏感。
　　结论:
　　NF-κB信号通路的活化介导了食管鳞癌对Linsitinib原发耐药。合用NF-κB抑制剂JSH-23，能够有效的克服食管鳞癌对Linsitinib耐药。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 前言

参考文献

2 第一部分 食管鳞癌原代细胞株的建立

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

参考文献

3 第二部分 胰岛素样生长因子1受体抑制剂Linsitinib在食管鳞癌中的作用

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

参考文献

4 第三部分 食管鳞癌对胰岛素样生长因子1受体抑制剂Linsitinib原发耐药的机制研究

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 结论

参考文献

综述 食管鳞癌基因组研究进展及精准治疗展望

作者简历及在学期间所取得的科研成果