芸薹属人工合成异源六倍体的稳定性分析、遗传图谱构建及QTL定位

摘要

异源多倍体在自然界中广泛存在并扮演重要角色，通常比普通低倍性物种生活力和环境适应性更强。然而自然界中并不存在芸薹属异源六倍体，本研究利用两个人工合成的芸薹属异源六倍体进行杂交并通过小孢子培养构建了一个DH（Doubled haploid，双单倍体）群体。分别研究了每个DH系的稳定性和重要的农艺性状后，挑选出各方面表现良好的DH系成为作图群体。利用SSR(Simplesequence repeats，简单重复序列)标记构建了首个包含A、B、C三个基因组的人工合成芸薹属异源六倍体的遗传连锁框架图，接着利用RAD-seq(Restrictionsite associated DNA sequencing，限制性酶切相关DNA测序)得到的SNP(Singlenucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)进行高密度遗传连锁图的构建，并成功定位出六个重要农艺性状的QTL（Quantitative trait loci，数量性状位点）。取得的主要创新性研究结果如下:
　　1、流式细胞仪检测发现235株DH系中有202株(85.96％)是六倍体，剩下33株(14.06％)是六倍体和三倍体的嵌合体，表明大部分DH系染色体数目都稳定在54条。根尖染色体数目观察的结果进一步验证了这个结果。10株DH系的花粉活性高于90％，6株几乎完全不育（花粉活性＜1％），平均花粉活性为52.35％。部分DH系的千粒重高于芸薹属二倍体基本种和四倍体复合种，表明该芸薹属人工合成六倍体的种子呈现出一定的巨大性。单株产量、每角粒数、角果长度偏低，可能是由于该六倍体减数分裂联会发生某些紊乱，一些性状的无法正常表达造成的。
　　2、578对SSR引物中有408对(70.6％)在亲本（7H170-1和Y54-2）和189个DH系中能扩增出多态性，共260对SSR引物成功构建到芸薹属人工合成异源六倍体遗传连锁框架图上，包含107个A基因组特异性引物、44个B基因组特异性引物和109个C基因组特异性引物。这些引物共扩增出274个多态性位点，A、B、C基因组上的多态性位点数目分别为109、49和116个。27个连锁群分别分布在A1-A10、B1-B8、C1-C9连锁群上，共覆盖3178.8 cM的遗传图距，相邻标记间的平均遗传图距是11.60 cM。每一个连锁群代表来自二倍体基本种和四倍体复合种的A、B、C基因组的每一条染色体。
　　3、利用限制性内切酶构建芸薹属人工合成异源六倍体亲本和来源于H16-1的146个DH系的RAD文库后，借助RAD-seq对亲本和DH群体进行测序。其中亲本的测序深度为2.59×，DH群体的测序深度为1.41×。在亲本和作图群体中一共获得2.87 G的illumina reads，其中2.49 G为高质量的reads。通过对亲本和DH群体中的290422个RAD reads进行无参聚类并过滤掉低质量的数据后，得到7950符合分离比(1∶1)的高质量SNP。利用这7950个SNP和270个用来构建遗传连锁框架图的SSR标记进行高密度遗传图谱的构建，共7511个SNP标记和151个SSR标记成功定位到27条连锁群上(A1-A10、B1-B8、C1-C9)，全长覆盖5725.19 cM，标记之间的平均遗传图距是0.75 cM。
　　4、利用QTL IciMapping4.1的完备区间作图法在SNP高密度遗传连锁图谱中对六个重要农艺性状（单株产量、千粒重、每角粒数、株高、角果长度和花粉活性）进行QTL定位，成功定位出25个QTL。此外，利用加性-完备区间作图法在单株产量、每角粒数、千粒重、花粉活性四个性状中成功检测出62对加加上位性QTL。针对两个QTL热点区域，分别预测出78和42个候选基因。这些加性QTL和上位性QTL可以用于图位克隆、基因定位和分子标记辅助育种，加速异源多倍体芸薹属新物种的育种利用速度以及异源六倍体的深入遗传特性等研究。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

缩略词表

1．1 引言

1．2 芸薹属植物远缘杂交的研究进展

1．2．1 芸薹属A、B、C基因组间的关系

1．2．2 芸薹属植物远缘杂交的研究进展

1．2．3 芸薹属植物远缘杂交在生产上的应用

1．3 多倍体育种的研究进展

1．3．1 多倍体的获取方法

1．3．2 植株倍性的鉴定

1．3．3 多倍体的应用

1．4 DNA分子标记

1．4．1 DNA分子标记的类型

1．4．2 简化基因组测序技术

1．4．3 分子标记的应用

1．5 遗传连锁图谱的构建

1．5．1 作图亲本的选择

1．5．2 作图分离群体的构建

1．5．3 遗传连锁图的构建原理和方法

1．6 数量性状遗传解析

1．6．1 数量性状的特点及研究方法

1．6．2 QTL定位的原理

1．6．3 QTL定位的方法

1．6．4 QTL定位的软件

1．6．5 芸薹属QTL定位的研究进展

1．7 本研究的目的和意义

第二章 芸薹属异源六倍体DH系稳定性分析及农艺性状鉴定

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 试验材料

2．2．2 试验方法

2．3 结果分析

2．3．1 DH系的植株倍性

2．3．2 DH系的染色体数目

2．3．3 DH系的花粉活性

2．3．4 DH系的表型性状

2．4 讨论

第三章 基于SSR分子标记的芸薹属异源六倍体的遗传连锁框架图的构建

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 亲本和DH群体基因组DNA提取及检测

3．2．3 SSR分子标记来源

3．2．4 PCR扩增反应及PAGE凝胶电泳分析

3．3 结果分析

3．3．1 基因组DNA的提取

3．3．2 引物在亲本中的多态性及DH群体中的分离

3．3．3 芸薹属异源六倍体遗传图谱构建

3．3．4 连锁群上SSR标记与之前的遗传图的比对

3．3．5 DH群体中连锁群的缺失频率分析

3．4 讨论与小结

3．4．1 讨论

3．4．2 小结

第四章 基于RAD-seq的芸薹属异源六倍体的高密度遗传连锁图谱的构建

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 试验材料

4．2．2 试验方法

4．3 结果分析

4．3．1 测序数据和基因分型

4．3．2 高密度遗传连锁图谱的构建

4．4 讨论

4．4．1 偏分离情况

4．4．2 连锁图谱的构建和分析

4．4．3 同源和异源重组分析

4．4．4 小结

第五章 芸薹属人工合成异源六倍体的QTL定位

5．1 引言

5．2 材料和方法

5．2．1 试验材料

5．2．2 试验方法

5．3 结果分析

5．3．1 加性QTL的定位

5．3．2 上位性QTL的定位

5．3．3 候选基因挖掘

5．4 讨论

5．4．1 加性QTL的分析

5．4．2 上位性QTL的分析

5．4．3 小结

第六章 结论与展望

6．1 研究结果与创新点

6．2 研究展望

参考文献

附录

博士期间主要成果